Введение
Глава 1. Обзор литературы "Маркеры метилирования ДНК в опухолях человека" 6-27
1.1. Введение 6-7
1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов 7-17
1.3. Профиль гиперметилированных генов в опухолях 17-22
1.4. Методы определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов в ДНК 22-24
1.5. Использование маркеров метилирования ДНК в клинической практике 24-27
Глава 2. Материалы и методы исследования 28-42
2.1. Список использованных реактивов 28-29
2.2. Клинические материалы 30
2.3. Клеточные линии 30
2.4. Обработка клеточных линий деметилирующим агентом 30
2.5. Выделение ДНК 31-32
2.5.1. Одновременное выделение ДНК и РНК 31
2.5.2. Выделение ДНК из лейкоцитов 31-32
2.6. Выделение плазмидной ДНК 32
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 32
2.6.2. Выделение плазмидной ДНК на колонках 32
2.7. Обработка ДНК рестриктазами 33
2.8. Бисульфитная конверсия ДНК 33-34
2.8.1. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 33-34
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 34
2.9. Полимеразная цепная реакция 34-37
2.9.1. Праймеры 35
2.9.2. Метилчувствительная П1ДР 36
2.9.3. Метилспецифическая ПЦР 36-37
2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии 37
2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР 37-38
2.10.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозных гелях 38
2.10.3. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 38-39
2.10.3.1. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на колонках 38
2.10.3.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на DEAE-целлюлозе 38-39
2.11. Клонирование продуктов ПЦР 39-40
2.11.1. Описание плазмид, использованных в работе в качестве вектора 39
2.11.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 39-40
2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli 40
2.12. Блот-гибридизация 40 2.12.1. Получение препаратов ДНК, меченных Р32 40-41
2.13. Реакция обратной транскрипции 41-42
Глава 3. Результаты: 43-62
3.1. Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-/32 в опухолях шейки матки 43-49
3.2. Анализ метилирования CpG-островка гена ТІМР-2 в опухолях шейки матки 50-63
3.2.1. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом блот гибридизации по Саузерну 50-52
3.2.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МЧ ПЦР 52-56
3.2.3. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом секвенирования ДНК после бисульфитной конверсии 57-59
3.2.4. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МС ПЦР 59-61
3.2.5. Влияние деметилирующих агентов на экспрессию TIMP-2 61-63
3.2.6. Сравнение частоты метилирования генов TIMP-2 и TIMP-3 в опухолях шейки матки 63
3.3. Определение статуса метилирования TIMP-2 в опухолях молочной железы 63-65
3.4. Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки 65-69
Глава 4. Обсуждение 70-75
Выводы 76
Список литературы 77-92
