Введение
2. Обзор литературы 6
2.1 Роль цитокинина в развитии и функционировании хлоропластов. 6
2.1.1 Регуляция цитокинином развития пластид. 6
2.1.2 Влияние цитокинина на содержание и активность хлоропластных белков. 8
2.1.3 Эффект цитокинина на транскрипцию и пост-транскрипционньте процессы РНК хлоропластных генов . 10
2.2 Регуляция транскрипции в хлоропластах. 12
2.2.1 Организация пластома. 12
2.2.2 РНК-полимеразы пластид. 14
2.2.3 Транскрипционные факторы. 19
2.2.3.1 Сигма факторы. 19
2.2.3.2 Другие трапс-факторы. 24
2.2.4 Промоторы. 27
2.2.5 Регуляция транскрипции хлоропластных генов. 31
2.2.6 Заключение, 36
3. Материалы и методы исследования 37
3.1 Объект исследования. 37
3.2 Выделение хлоропластов из листьев ячменя. 37
3.3 Бактериальные штаммы и векторы, 40
3.4 Выделение ДНК. 40
3.4.1 Выделение тотальной растительной ДНК. 40
3.4.2 Выделение хлоропластной ДНК. 41
3.4.2.1 Выделение ДНК из изолированных хлоропластов. 41
3.4.2.2 Выделение хлоропластной ДНК в растворе высокой ионной силы. 41
3.4.3 Выделение плазмидной ДНК. 42
3.4.3.1 Микровыделение плазмидной ДНК. 42
3.4.3.2 Макровыдслепие плазмидной ДНК. 43
3.5 Клонирование фрагментов ДНК. 44
3.5.1 Подбор праймеров к клонируемому гену, 44
3.5.2 Полимеразная цепная реакция. 45
3.5.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 47
3.5.4 Элюция фрагментов ДНК из геля. 48
3.5.5 Лигирование. 48
3.5.6 Трансформация клеток Е. соїі лигационпой смесью. 49
3.5.6.1 Приготовление компетентных клеток. 49
3.5.6.2 Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК. 50
3.5.7 Выращивание бактерий на агаризованной LB среде. 51
3.5.8 Поиск бактериальных колоний, несущих рекомбинантные плазмиды . 51
3.6 Рестрикция фрагментов ПЦР, плазмидной и хлоропластной ДНК. 54
3.7 Метод run on транскрипции, 57
3.7.1 Нанесение фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану. 57
3.7.2 Подсчет количества хлоропластов. 57
3.7.3 Синтез меченных транскриптов в хлоропластом лизате. 58
3.7.4 ДНК-РНК гибридизация. 59
3.7.5 Экспозиция нейлоновой мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов. 60
3.8 Нозсрп (Nothern) гибридизация. 60
3.8.1 Выделение тотальной растительной РНК с помощью триозола. 60
3.8.2 Электрофорез РНК в агарозном геле. 61
3.8.3 Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану. 61
3.8.4 Синтез меченого зонда. 62
3.8.5 РНК-ДНК гибридизация. 62
3.8.6 Экспозиция нитроцеллюлозной мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов . 63
4. Результаты и обсуждения 64
4.1 Клонирование фрагментов хлоропластных генов. 64
4.2 Эффект эндогенных и экзогенных факторов на регуляцию транскрипции
индивидуальных хлоропластных генов цитокинином. 70
4.2.1 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях
первого яруса 4-дневных проростков ячменя. 70
4.2.2 Поиск условий постановки эксперимента, при которых экзогенный цитокинин регулирует транскрипцию хлоропластных генов в листьях ячменя. 75
4.2.3 Влияние экзогенного цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 4-дпевных проростков ячменя, выращенных на перлите. 77
4.2.4 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дневных проростков ячменя. 81
4.2.5 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дпевных проростков ячменя, прединкубированных 24 часа на воде . 84
4.3 Некоторые аспекты регуляции транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином. 89
4.3.1 Влияние постоянного освещения на этапе прединкубации на регуляцию транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином. 89
4.3.2. Регуляция транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином в разных зонах листа и в листьях, отделенных от растений разного возраста. 92
4.3.3 Регуляция транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином в изолированных хлоропластах. 99
4.3.4 Исследование регуляции транскрипции хлоропластных генов цитокинином в листьях мутанта ячменя albostrians. 103
4.3.5 Влияние цитокинина на тотальное содержание индивидуальных РНК некоторых хлоропластных генов. 105
5. Заключение 107
6. Выводы 111
7. Список литературы 113
8. Список сокращений 136
