Введение
I. Обзор литературы 10
1. Активные формы кислорода (ЛФК) 10
1.2. Химическая природа АФК 10
1.2. Цитотоксические эффекты АФК . 13
1.3. Биологические источники АФК.. 15
1.4. Метаболизм АФК в клетках 17
2. Супероксиддисмутазы: различные типы, эволюция структуры и функции ферментов 23
2.1. Железо-содержащиеСОД 24
2.2. Марганец-содержащие СОД 25
2.3. Камбиалистические СОД , 26
2.4. Медь/цинк-содержащие СОД ...28
2.5. Никель-содержащие СОД 30
3. Исследования клеточных функций супероксиддисмутаз 30
3.1. Мутационный и комплсментационный анализ 31
3.2. Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков 33
4. Характеристика генных семейств СОД растений 41
4.1. Структура генных семейств СОД растений 42
4.2. Регуляция экспрессии генов СОД растений 44
4.3. Представления об эволюции структуры и функции генов СОД растений 47
5. Состояние исследований генов СОД у хвойных растении 48
6. Итоги обзора литературы 50
II. Материалы и методы 51
1. Объект исследования 51
2. Использованные методы 52
2.1. Выделение ДНК 52
2.2. Выделение РНК 52
2.3. Подбор праймеров для ПЦР и ОТ-ПЦР 53
2.4. Условия ПЦР на геномной ДНК 55
2.5. Синтез первой цепи кДНК 55
2.6. Условия ОТ-ПЦР 55
2.7. Условия 3RACE 55
2.8. Условия 5RACE 56
2.9. Электрофоретическое разделение продуктов синтеза первой цепи кДНК в денатурирующих условиях 57
2.10. Электрофоретическое разделение и очистка продуктов ПЦР, ОТ-ПЦР, 3 RACE и 5RACE 57
2.11. Клонирование фрагментов кДНК 58
2.12. Выделение плазмидпой ДНК 59
2.13. Условия секвенирования ДНК 59
2.14. Саузерн-гибридизация 59
2.15. Нозерн-гибридизация 60
2.16. Контекстный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...61
III. Результаты и обсуждение 62
1. Получение ОТ-ПЦР-продуктов, соответствующих высококонсервативным участкам генов СОД растений 62
1.1. Анализ последовательностей генов СОД растений и подбор праймеров 62
1.2. ОТ-ПІДР на мРНК растений различных систематических групп 64
2. Секвенирование фрагмента кДНКгена FeCOMZea mays, доказательства широкого распространения генов ГеСОДу растений и контекстный анализ аминокислотных последовательностей ГеСОД. 67
2.1. Секвенирование и сравнение кДНК ИеСОД кукурузы с высокогомологичными последовательностями других растений 67
2.2. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей Fe-, Мп- и камбиалистических СОД прокариот и эукариот 69
2.3. Стрсссоиндуцируемая экспрессия гена РеСОД Zea mays 72
3. Исследование структуры гена хлороиластной СиМпСОД кукурузы 73
3.1. Секвенирование и анализ кДНК гена хлоропластной Си/гпСОД Z mays 73
3.2. Сравнительный анализ структурных особеностей генов хлоропластных Cu/ZnCOflZ mays 76
4. Исследование особенностей структуры генов Си/ЕпСОД лиственницы 78
4, 1. Секвенирование и анализ кДНК генов Cu/ZnCOfl Larix sibirica и L. gmelinii 78
4.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З-концевых последовательностей кДНК генов СиЙпСОД лиственницы ...79
4.3. Анализ З-концевых участков кДНК двух видов Larix 83
4.4. Определение количества копий генов СийпСОД Larix sibirica и L. gmelinii с помощью методов Саузерн-гибридизации и ПЦР 84
5. Исследование особенностей структуры генов МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.%1
5 1. Секвенирование и анализ кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii 87
5.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З-концсвых последовательностей кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii., 87
5.3. Определение копийпости генов МпСОД L. gmelinii и L. sibirica с использованием методов ОТ-ПЦР и ПЦР на геномной ДНК 92
5.4. Роль альтернативного полиаденилирования траискриптов генов МпСОД в регуляции экспрессии данных генов 93
Заключение 98
Выводы 101
Список литературы 102
