Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Типы аутофагии 12
1.2. Молекулярные механизмы аутофагии 14
1.3. Биогенез аутофагосом 23
1.4. Селективная и неселективная аутофагия 28
1.5. Физиологическая роль аутофагии в растениях 31
1.5.1. Аутофагия входе роста и развития 31
1.5.2. Аутофагия при стрессе 33
1.6. АФК и окислительные модификации макромолекул 36
1.7. Программируемая клеточная смерть у растений 43
2. Объекты и методы исследований 50
2.1. Объекты исследований 50
2.2. Определение содержания Н202 50
2.3. Определение интенсивности ПОЛ 51
2.4. Определение жизнеспособности клеток 51
2.5. Определение протеазной активности 51
2.6. Конфокальная микроскопия 52
2.7. Исследования ультраструктуры клеток 52
2.8. Выделение РНК, проведение ОТ-ПЦР в реальном времени и анализ экспрессии генов 53
2.9. Выделение РНК и проведение ОТ-ПЦР для получения полноразмерных кДНК 55
2.10 Выделение геномной ДНК растений пшеницы и проведение ПЦР
для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) 56
2.11. Клонирование кДНК 56
2.12. Карта вектора pET-51b(+) Ek/LIC 58
2.13. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 60
2.14. Получение и очистка рекомбинантного белка 60
2.15. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
в агарозном геле 62
2.16. Одномерное электрофоретическое разделение белков 62
2.17. Метод полусухого блоттирования (вестерн-блоттинг) 62
2.18. Инфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия) 63
2.19. ЯМР-спектроскопия 64
2.20. Биоинформатический анализ последовательностей 65
2.21. Статистическая обработка 65
3. Результаты и обсуждения 66
3.1. Стресс-индуцированная аутофагия в корнях проростков пшеницы... 66
3.1.1. Активация аутофагии при окислительном стрессе 66
3.1.2. Индукция аутофагии при раневом стрессе 71
3.1.3. Активация аутофагии при действии ингибиторов ЭТЦ митохондрий 75
3.1.4. Стадии образования аутофагосом в условиях окислительного стресса 83
3.2. Характеристика структуры аутофагического белка ATG8g пшеницы 86
3.2.1. Особенности первичной структуры белка 7cATG8g и TaATG4 86
3.2.2. Клонирование и секвенирование экзон-интронной последовательности гена TaATG8g 94
3.2.3. Получение и очистка рекомбинантного белка 7cATG8g 96
3.2.4. Пространственная структура белка 7cATG8g 101
3.2.5. Трехмерная модель белка 7cATG8g 108
Заключение 113
Выводы 116
Список литературы
