Введение
Обзор литературы 8
1. Общая характеристика. 8
1.1. Общая характеристика рода Flavivirus. 8
1.2. Процессинг вирусного полипротеина. 11
1.3. Структурные белки флавивирусов. 13
1.4. Неструктурные белки флавивирусов . 15
1.5. Репликация РНК. 19
2. Патогенетические характеристики ВКЭ. 23
2.1. Клиническая картина клещевого энцефалита. 23
2.2. Распространение вируса в организме. 26
2.3. Генотипы вируса клещевого энцефалита и их распространение. 27
2.4. Связь генотипов с вирулентностью. 28
2.5. Связь различных участков генома с вирулентностью . 29
3. Иммунный ответ при клещевом энцефалите. 33
3.1. Особенности формирования противовирусного иммунного ответа. 33
3.2. Иммунный ответ при клещевом энцефалите. 38
3.3. Факторы, определяющие течение заболевание при инфекции вирусом клещевого энцефалита. 42
3.4. Общие сведения об интерфероновой системе. 43
4. Связь гетерогенности вирусной популяции с патогенетическими характеристиками вируса. 57
4.1. Общие положения эволюции популяции РНК-вирусов. 57
4.2. Изменение вирусной популяции при смене хозяина. 61
4.3. Фенотипические и генетические изменения вируса клещевого энцефалита при адаптации к клещам и млекопитающим. 65
4.4. Характеристика ревертантов, полученных при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ с помощью клонирования. 67
Материалы и методы 70
1. Используемые вирусы. 70
2. Используемые культуры клеток млекопитающих. 70
3. Лабораторные животные. 71
4. Получение гипериммунной асцитной жидкости. 71
5. Олигонуклеотиды 71
6. Получение вируссодержащей суспензии мозга и селезенки мыши. 71
7. Титрование инфекционного вируса. 71
8. Титрование ВКЭ на мышах. 72
9. Клонирование вируса методом бляшек. 72
10. Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток. 72
11. Моделирование инфекции. 73
12. Определение концентрации -, -IFN и -IFN в сыворотках крови мышей. 73
13. Определение IFN-чувствительности ВКЭ методом титрования. 74
14. Иммуноферментный анализ. 74
15. Методы работы с белками. 74
15.1. Приготовление проб для изучения экспрессии вирусных белков. 74
15.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. 75
15.3. Вестерн-блот. 75
16. Методы работы с нуклеиновыми кислотами. 76
16.1. Выделение РНК. 76
16.2. Обратная транскрипция. 76
16.3. Полимеразная цепная реакция. 77
16.4. Полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени (RealTimePCR). 78
16.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле. 78
16.6. Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы. 79
16.7. Определение нуклеотидной последовательности. 79
16.8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. 80
Результаты 81
1. Определение полных нуклеотидных последовательностей геномов ревертантов 58 и 57. 84
2. Оценка вирулентности исследуемых вирусных вариантов на мышах. 87
3. Детальная характеристика начальных этапов инфекции. 89
3.1. Динамика появления вируса в крови, селезенке и мозге инфицированных животных на ранних стадиях инфекции при заражении вариантами ВКЭ . 89
3.2. Динамика индукции интерферонов на ранних этапах инфекции. 94
4. Изучение динамики размножения вариантов вируса клещевого энцефалита в различных культурах клеток. 98
4.1. Характеристика репродукции выбранного набора вирусов в перевиваемых культурах клеток. 99
4.2. Изучение цикла репродукции вариантов ВКЭ в культуре клеток СПЭВ . 100
4.3. Детальное изучение цикла репродукции вариантов штамма ЭК-328 в культуре первичных фибробластов, а также в перевиваемой культуре клеток мышиных фибробластов L-929 и макрофагоподобных клеток Р388. 104
5. Пассирование штамма ЭК-328, варианта М и ревертанта 58 в перевиваемой культуре макрофагоподобных клеток и фибробластов мыши. 119
5.1. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках L-929. 120
5.2. Оценка вирулентности вирусных вариантов после 15-го пассажа на клетках L-929. 121
5.3. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей вариантов ВКЭ, адаптированных к клеткам мышиных фибробластов L-929. 123
5.4. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках Р388. 125
Обсуждение 127
Выводы 141
Список литературы 143
