Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы 9
2.1. Регуляция клеточного цикла 9
2.2. Роль МАР-киназных каскадов в контроле клеточного цикла 13
2.3. Транскрипционный фактор АР-1 18
2.3.1. Основные свойства АР-1 19
2.3.2. Роль белков АР-1 в пролиферации клеток 20
2.3.3. Роль белков семейства Fos в составе АР-1 23
2.3.4. Регуляция активности АР-1 23
2.3.5. Регуляция транскрипции генов, кодирующих АР-1 24
2.3.5.1. Регуляция транскрипции гена c-jun 24
2.3.5.2. Регуляция транскрипции гена c-fos 25
2.4. Структура хроматина и регуляция транскрипции 29
2.4.1. Хроматин-модифицирующие ферменты 29
2.4.3. HAT и транскрипционная активация 30
2.4.4. HDAC и транскрипционная репрессия 32
2.4.5. Нарушение ацетилирования гистонов и рак 34
2.5. Ингибиторы HDAC 35
2.6. Онкогены и опухолевая трансформация клеток 38
2.6.1. Классификация онкогенов 39
2.6.3. Онкоген Е1А раннего района аденовируса человека и контроль клеточного цикла 40
2.6.3.1. Мишени Е1А - Белки семейства Rb 41
2.6.3.2. Мишени Е1А - циклины и циклин-зависимые киназы 42
2.6.3.3. Мишени Е1А - HAT, HDAC и реорганизация хроматина 43
2.6.3.4. Мишени Е1А-транскрипционный комплекс АР-1 45
2.6.4. Цитоплазматический онкоген ras. Функции белков Ras в проведении
сигнала 46
2.6.2. Трансформация клеток 50
2.6.5. Трансформация онкогенами Е1А исНа-гая 50
ГЛАВА 3. Материалы и методы 54
3.1. Культивирование клеток 54
3.2. Обработка клеток ингибиторами 54
3.3. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 54
3.4. Иммунопреципитация 55
3.5. Анализ содержания белков методом иммуноблотинга 55
3.6. Получение ядерных экстрактов 57
3.7. Фосфорилирование белков in vitro 57
3.8. Диск-электрофорез белков по Лэмли 58
3.9. RT-PCR анализ транскрипции генов 58
3.10. Кинирование двуцепочечного олигонуклеотида SRE в присутствие у-32Р-АТР 59
3.11. Задержка подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA) 59
3.12. Анализ фрагментации клеточной ДНК 60
3.13. Флуоресцентная окраска хроматина 61
ГЛАВА 4. Результаты 62
4.1. Трансформация клеток REF онкогенами Е1А и cHa-ras приводит к конститутивной активности МАР киназ 62
4.1.1. Содержание киназ ERK, INK и р38 в трансформантах ElA+cHa-ras повышено по сравнению с клетками REF52 63
4.1.2. Трансформанты ElA+cHa-ras характеризуются повышенным содержанием фосфорилированных форм MAP киназ 63
4.1.3. Активность киназ ERK и р38 повышена в трансформантах Е1А+сНа-ras 65
4.2. Экспрессия генов раннего ответа по-разному дерегулирована в клетках, трансформированных онкогенами Е1А и cHa-ras 69
4.3. Анализ экспрессии TCF-белков в клетках REF и ElA+cHa-ras 72
4.4. Транскрипционный фактор Elk-1 конститутивно фосфорилирован в трансформантах ElA+cHa-ras 74
4.4.1. Белок Elk-1 доминирует в составе тройных комплексов, связывающихся с областью SRE 74
4.4.2. Сывороточная стимуляция не увеличивает содержания тройных комплексов SRF/SRF/TCF в клетках ElA+cHa-ras 76
4.4.3. Анализ статуса фосфорилирования транскрипционного фактора Elk-1 в трансформантах El А+сНа-гау 78
4.4.4. Анализ активности Elk 1-ассоциированных киназ 78
4.5. MEK/ERK-киназный каскад является доминирующим в фосфорилировании белка Elk-1 в трансформантах ElA+cHa-ras 80
4.6. Анализ взаимодействия белка Elk-1 с деацетилазой гистонов HDAC-1 82
4.7. Бутират натрия селективно активирует транскрипцию протоонкогена с-fos в трансформантах ElA+cHa-ras 85
4.8. Исследование регуляции клеточного цикла трансформантов ElA+cHa-ras при обработке ингибитором HDAC бутиратом натрия 88
4.8.1. Эффект бутирата натрия на клеточный цикл трансформантов ElA+cHa-ras 89
4.8.2. NaB не вызывает апоптоза в трансформантах ElA+cHa-ras 89
4.8.3. Анализ экспрессии регуляторов клеточного цикла в трансформантах ЕІА+сНа-ras, обработанных NaB 92
4.8.4. Анализ способности белка p21/Wafl взаимодействовать с циклин-киназными комплексами в клетках, обработанных NaB 97
4.8.5. Анализ активности циклин-киназных комплексов в клетках Е1А+сНа-ras, обработанных NaB 97
ГЛАВА 5. Обсуждение 100
5.1. Активация МАР-киназ при трансформации онкогенами Е1А и cRa-ras. 100
5.2. Модуляция экспрессии генов раннего ответа при трансформации онкогенами Е1А и сНа-гая 103
5.3. Роль структуры хроматина в репрессии транскрипции протоонкогена c-fos в трансформантах ЕІА+сНа-ras 106
5.4. Ингибиторы HDAC и клеточный цикл трансформантов ElA+cRa-ras.. 109
5.4.1. Ингибитор HDAC бутират натрия модулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл 110
5.4.2. Роль белка p21/Wafl в NaB-индуцированной остановке пролиферации трансформантов ЕІА+сНа-ras 113
Выводы 116
Список сокращений 117
Список работ, опубликованных по теме диссертации.119
Список литературы
