Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 11
1.1. Строение ядра и хромосомного аппарата микроспоридий 11
1.1.1. Общая организация ядра 11
1.1.2. Митоз у микроспоридий 12
1.1.3. Половой процесс у микроспоридий: закономерности изменения плоидности ядер диплокариона 15
1.1.4. Хромосомные циклы микроспоридий. Классификация жизненных циклов...25
1.2. Способы изучения кариотипа у протистов 30
1.3. Кариотипирование протистов с помощью метода пульс-электрофореза 32
1.4. Определение размера генома и уровня плоидности у протистов 39
1.5. Молекулярные кариотипы, размер генома и хромосомный полиморфизм у микроспоридий 41
ГЛАВА 2. Материал и методы 50
2.1. Методы лабораторной работы с микроспоридией Paranosema grylli 50
2.1.1. Происхождение культуры микрослоридии 50
2.1.2. Поддержание микроспоридии в культуре насекомых-хозяев 50
2.1.3. Выделение и очистка стадий жизненного цикла микроспоридии из жирового тела сверчка 51
2.1.4. Стимуляция экструзии полярных трубок из спор P. grylli и получение препарата спороплазм 54
2.2. Методы световой и электронной микроскопии 55
2.2.1. Световая микроскопия и гистохимическое окрашивание 55
2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 56
2.3. Методы цитометрии 56
2.3.1. Кислотный гидролиз и окрашивание препаратов для цитометрии 56
2.3.2. Измерение содержания ДНК в ядрах диплокариона с помощью цитометрии по изображению 57
2.4. Базовые молекулярно-биологические методы 5
2.4.1. Выделение геномной ДНК из спор P. grylli 5Е
2.4.2. Амплификация ДНК 6*
2.4.3. Клонирование продуктов ПЦР 6f
2.4.4. СеквенированиеДНК 66
2.4.5. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 66
2.5. Молекулярное кариотипирование 67
2.5.1. Приготовление образцов высокомолекулярной хромосомной ДНК Р grylli для пульс-электрофореза 67
2.5.2. Приготовление агарозных блоков с размерными маркерами для пульс-электрофореза 72
2.5.3. Пульс-электрофорез хромосомной ДНК 73
2.5.4. KARD 2-D PFGE 79
2.5.5. Гибридизация поСаузерну 81
ГЛАВА 3. Результаты 83
3.1. Изучение структуры диплокариона и хромосомного аппарата Paranosema grylli 83
3.1.1. Интерфаза 83
3.1.2. Митоз и цитокинез 84
3.1.3. Мейоз 90
3.2. Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Paranosema grylli 94
3.2.1. Фракционирование хромосомных ДНК P. grylli с помощью пульс-электрофореза 94
3.2.2. Особенности молекулярного кариотипа микроспоридии P. grylli 103
3.3. Идентификация индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе Paranosema grylli с помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE) 105
3.4. Локализация ген-специфичных зондов на хромосомах Paranosema grylli 110
3.4.1. Гибридизация с ДНК-зондами коднокопийным
белок-кодирующим генам 110
3.4.2. Локализация ДНК-зонда к гену 16SpPHK 112
3.5. Определение абсолютного содержания ДНК в спорах
Paranosema grylli и оценка уровня плоидности ядер диплокариона 115
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 119
4.1. Особенности организации диплокариона и хромосомного аппарата у Paranosema grylli 119
4.1.1. Интерфаза 119
4.1.2. Митоз 122
4.2. Особенности протекания мейоза и его место в жизненном цикле Paranosema grylli 125
4.2.1. Морфологические маркеры мейоза у P. grylli: сравнение с другими микроспоридиями 125
4.2.2. Место мейоза в жизненном цикле P. grylli 127
4.3. Хросомный набор микроспоридии Paranosema grylli. Полиморфизм гомологичных хромосом и его возможные причины 128
4.3.1. Популяционная структура P. grylli 129
4.3.2. Уровень плоидности диплокариона микроспоридий 130
4.3.3. Возможные сценарии хромосомных перестроек в ходе пролиферации P. grylli 132
4.3.4. Репродуктивная стратегия P. grylli 139
4.3.5. Функциональное значение хромосомного полиморфизма 141
4.4. Хромосомный репертуар и размер генома Paranosema grylli в сравнении с другими микроспоридиями 142
4.5. Биологическое значение межъядерной гомогенизации геномов и возможные варианты ее реализации у мономорфных
диплокариотических микроспоридий ...145
Заключение 149
Выводы 151
Список литературы
