Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Значение устойчивости к антибиотикам у возбудителей внутрибольничных инфекций семейства Enterobacteriaceae 14
1.2 Распространенность клинически значимых штаммов Enterobacteriaceae, возбудителей нозокомиальных инфекций 18
1.3 Механизмы формирования устойчивости к антибактериальным средствам 21
1.4 Генетические детерминанты устойчивости к бета-лактамам 26
1.4.1 Бета-лактамазы 26
1.4.2 Хромосомные и плазмидные гены бета-лактамаз 28
1.5 Генетические детерминанты ассоциативной устойчивости и их локализация в геноме бактерий 36
1.5.1 Гены, кодирующие устойчивость к аминогликозидам 36
1.5.2 Гены, кодирующие устойчивость к фторхинолонам 38
1.5.3 Гены, кодирующие устойчивость к сульфаниламидам 39
1.6 Роль мобильных генетических элементов в быстром распространении генов устойчивости к антибактериальным препаратам 40
1.6.1 Геномные острова 40
1.6.2 Плазмиды 42
1.6.3 Транспозоны и IS-элементы 43
1.6.4 Интегроны 47
1.6.5 Рекомбинация 50
1.7 Методы изучения устойчивости к антибактериальным препаратам 51
1.7.1 Микробиологические методы 51
1.7.2 Биохимические методы 54
1.7.3 Биофизические методы 55
1.7.4 Генетические методы 56
1.7.5 Молекулярно-генетические методы 59
1.7.6 Методы биоинформатики 69
1.8 Заключение по обзору литературы 73
Собственные исследования 76
Глава 2 Материалы и методы 76
2.1 Микробиологические методы 76
2.1.1 Изоляты бактерий 76 2.1.2 Выращивание микроорганизмов 77
2.1.3 Определение чувствительности к антибиотикам 77
2.1.4 Тест на наличие БЛРС 77
2.2 Молекулярно-генетические методы 78
2.2.1 Специфические праймеры для ПЦР-детекции генов 78 антибиотикоустойчивости 2.2.2 Подготовка матрицы ДНК 78
2.2.3 Амплификация ДНК 78
2.2.4 Электрофорез в агарозном геле 79
2.2.5 Рестрикционный анализ ПЦР-продуктов 79
2.2.6 Определение размеров фрагментов ДНК 80
2.2.7 Секвенирование ДНК 80
2.2.8 Конъюгативный перенос плазмид 80
2.2.9 Выделение плазмидной ДНК 81
2.2.10 Изучение плазмидных профилей изолятов и 81 штаммов 2.2.11 Рестрикционный анализ плазмид 81
2.2.12 Гибридизация ДНК-ДНК 82
2.2.13 Определение групп несовместимости (Inc) плазмид 82
2.3 Биоинформатические методы 82
2.3.1 Анализ последовательностей ДНК с помощью 82 программы Vector NTI9 2.3.2 Выравнивание последовательностей ДНК 82
2.3.3 Размещение последовательностей ДНК в базе данных GenBank 82
Глава 3 Результаты и обсуждение 85
3.1 Сравнение коллекций нозокомиальных изолятов
семейства Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003 2004 гг. и в 2005-2007 гг 85
3.1.1 Анализ видового состава и источников выделения нозокомиальных изолятов энтеробактерий 85
3.1.2 Фенотипы устойчивости изолятов к цефалоспоринам III-IV 87
3.1.3 Фенотипы устойчивости изолятов к антибактериальным препаратам других функциональных классов 89
3.2 Детекция генетических детерминант антибиотикоустойчивости 91
3.2.1 ПЦР-скрининг на наличие генов бета-лактамаз 91
3.2.2 Разработка алгоритма идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-типа, методом ПЦР-ПДРФ 93
3.2.3 Идентификация генов ЫаСтх-м в нозокомиальных изолятах энтеробактерий 101
3.2.4 Идентификация нового гена 6/астх-м-пб 104 3.2.5 Изучение генетического окружения генов Ыастх-м-- Мб
3.2.6 Анализ генов ассоциативной устойчивости, локализованных в вариабельных участках интегронов 1 класса 113
3.2.7 Обнаружение генов qnr - плазмидных детерминант устойчивости к хинолонам 117
3.2.8 Изучение конъюгативных плазмид, несущих гены антибиотикоустойчивости 119
3.2.9 Локализация генов резистентности и интегронных структур на конъюгативных плазмидах 123
3.2.10 Определение групп несовместимости конъюгативных плазмид 124
3.2.11 Создание перечня специфичных маркеров для характеристики множественно устойчивых госпитальных штаммов энтеробактерий 128
Заключение 129
Выводы 130
Список литературы
