Введение
Глава 1. Материалы и Методы 17
1.1 Клеточные линии и условия культивирования 17
1.2 Образцы тканей 17
1.3 Выделение нуклеиновых кислот 18
1.3.1 Выделение плазмидной ДНК 18
1.3.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей 19
1.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агароз ных гелей 19
1.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 20
1.5 Молекулярное клонирование 20
1.5.1 Получение компетентных клеток E. coli 20
1.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli 21
1.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 21
1.5.4 Реакция лигирования 21
1.5.5 Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК и получение экспрессирующих векторов 22
1.5.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК 22
1.6 Обратная транскрипция РНК 23
1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23
1.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23
1.7.2 ПЦР в реальном времени 24
1.8 Трансфекция и получение псевдовирусных частиц 26
1.9 Инфекция псевдовирусными частицами 27
1.10 Анализ белков 27
1.10.1 Приготовление клеточных лизатов 27
1.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого 28
1.10.3 Электрофорез белков и Вестерн-блот гибридизация 28 1.10.4 Анализ активности фосфолипазы PLD 30
1.10.5 Анализ активности малой ГТФазы Ral 31
1.10.6 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса 31
1.10.7 Анализ желатиназной активности 31
1.10.8 Анализ активности uPA 32
1.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro 32
1.11.1 Анализ динамики пролиферации 32
1.11.2 Анализ динамики пролиферации с использованием МТТ 32
1.11.3 Анализ подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay) 33
1.11.4 Анализ клоногенности (тест на образование колоний в условиях разреженной популяции 33
1.11.5 Анализ способности к неприкрепленному росту (тест на образование колоний в полужидкой среде) 33
1.11.6 Анализ направленного движения по градиенту концентрации факторов роста 34
1.11.7 Анализ инвазивной активности (тест на инвазию in vitro) 34
1.12 Исследование клеточных характеристик in vivo 34
1.12.1 Определение туморогенности и динамики роста опухолей 34
1.12.2 Определение экспериментальной (ЭМА) и спонтанной (СМА) метаст атической активности 35
1.13 Иммуногистохимический анализ ( ИГХ). 35
1.14 Статистическая обработка результатов 36
1.15 Растворы, реагенты и среды 36
Глава 2. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала 39
2.1. Состояние проблемы 39
2.2.Собственные результаты 60
2.2.1 Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути 60
2.2.2 Роль малой ГТФазы RalА в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток 66
2.2.3. Значение активации RalА в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов и трансформированных фибробластов, прошедших селекцию in vivo 67
2.3.Обсуждение результатов 74
Глава 3. Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами высоко-агрессивного фенотипа и метастатической активности 79
3.1 Состояние проблемы 79
3.2 Собственные результаты 100
3.2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов 100
3.2.2 Совместная экспрессия белков RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению метастатической активности 103
3.2.3 Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток .. 105
3.2.4 Анализ изменения экспрессии белков: Cyclin D1, CD-24, Cav-1, а также активности белков Erk1/2, Jnk, p38 и Stat3 под влиянием экспрессии экзогенных белков RalA и RalB 114
3.2.5 Определение эффекторных мишеней белков RalA и RalB, взаимодействие с которыми необходимо для реализации их прометастатической функции. 118
3.3 Обсуждение результатов 122
Глава 4. Роль малой ГТФазы Arf6 в пролиферации, инвазии и активации ключевых в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей 131
4.1 Состояние проблемы 131
4.2 Собственные результаты 171
4.2.1 Сравнение влияния экспрессии экзогенного Arf6, а также его совместной экспрессии с белками RalA/RalB на метастатическую активность трансформированных фибробластов 179
4.2.2 Arf6-зависимая стимуляция пролиферации и активация фосфолипазы D 179
4.2.3 Идентификация Arf6/PLD/mTORC1/S6K1/S6 и Arf6/PLD/mTORC1/4E-BP1 сигнальных путей, приводящих к Arf6-зависимой активации комплекса инициации трансля ции 187
4.2.4 Влияние Arf6 на активацию МАР киназ Erk1/2, Jnk и p38 194
4.2.5 Молекулярные механизмы Arf6-зависимой стимуляции пролиферации включают активацию мTORC1 комплекса и МАР киназы р38 196 4.2.6 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в клинических образцах
опухолей немелкоклеточноно рака легкого 201
4.3 Обсуждение результатов 207
Глава 5. Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, в усилении высокоагрессивного фенотипа трансформированных клеток 217
5.1 Состояние проблемы 217
5.2 Собственные результаты 228
5.2.1 Корреляция экспрессии CRABP1 с уровнем спонтанной
метастатической активности трансформированных
фибробластов 228
5.2.2.Модуляция туморогенности и метастатической активности
клеток при активации и подавлении экспрессии CRABP1 230
5.2.3.Анализ экспрессии мРНК и продукции белка CRABP1 в
клинических образцах опухолей мезенхимального
происхождения – мягкотканых сарком различного генеза 239
5.2.3.1 Изучение экспрессии мРНК СRABP1 и CRABP2 в образцах опухолей мягких тканей человека 239
5.2.3.2 Анализ экспрессии белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком 242
5.3 Обсуждение результатов 244
Заключение 248
Выводы 252
Список сокращений и условных обозначений 254
Список литературы
