Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы 18
Глава 1. Транспорт гормонов первой группы в плазме крови человека 18
1.1. Липокалины 21
1.2. Транспортные белки крови, не относящиеся к липокалинам
Глава 2. Гормондепонирующая функция эритроцитов и транс порт гормонов второй группы. 35
Глава 3. Особенности транспорта инсулина в крови человека. 39
Глава 4. Применение аффинной хроматографии в медицине и биотехнологии 43
4.1 .Виды аффинной хроматографии 44
4.2. Носители для аффинной хроматографии и методы их активации
4.3. Использование поливинилового спирта в медицине и биотехнологии
4.4. Аналитические системы на основе аффинных сорбентов 56
ЧАСТЬ 2. Экспериментальная часть 61
Глава 5. Объекты исследований, реактивы и материалы 61
5.1. Принципы формирования групп добровольцев при изучении системы транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа
5.2.0сновные реактивы для синтеза аффинных сорбентов 62
5.3. Реагенты белковой природы и иммунологические препараты
Глава 6. Методы исследований 63
6.1. Химические методы 63
6.1.1. Синтез аффинных сорбентов 63
6.1.2. Качественное определение альдегидных групп активированного глутаровым альдегидом ПВС-носителя
6.1.3. Определение оксирановых групп ПВС-носителя 65
6.1.4 Получение диазопроизводного овальбумина 66
6.2. Хроматографические методы 66
6.2.1. Иммуноаффинное извлечение антигенных примесей из препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона
6.2.2. Выделение иммуноглобулинов (иммунных комплексов) из фракций связывающих инсулин белков 68
6.2.3. Выделение антител к овальбумину на иммобилизованном антигене 68
6.2.4. Аффинное определение гликозилированного гемоглобина 68
6.2.4.1. Приготовление гемолизатов 68
6.2.4.2. Хроматографическое выделение гликозилированного гемоглобина на сорбенте, содержащем дигидроксиборильные группы 69
6.2.5. Определение фракции HbAic гемоглобина методом высокоэффективной ионообменной хроматографии 71
6.2.6. Иммобилизация инсулина на активированной бромцианом матрице 71
6.2.7. Проведение хроматографического выделения связы- вающих инсулин белков сыворотки человека 72
6.2.8. Проведение гельхроматографии 73
6.3. Иммуноферментный анализ 74
6.4. Иммунолюминесцентное определение гормонов 76
6.5. Количественная оценка инсулинсвязывающей активности сыворотки крови 76
6.5.1. Формалинизация эритроцитов 77
6.5.2. Приготовление эритроцитарных диагностикумов 77
6.5.3. Определение концентрации связывающих инсулин белков крови в реакции пассивной гемагглютинации
6.5.4.Титрование антител к овальбумину в реакции пассивной гемагглютинации 78
6.5.5. Определение овальбумина в реакции торможения пассивной гемагглютинации
6.6. Анализ спектров поглощения проб в ультрафиолетовой области спектра 80
6.7. Проведение электрофореза
6.7.1. Метод проведения электрофореза белков на ацетатцел- люлозных пленках 80
6.8. Изоэлектрическое фокусирование с иммунопроявлением 81
6.8.1. Подготовка стеклянной подложки 81
6.8.2. Формирование геля 82
6.8.3. Проведение изоэлектрического фокусирования 83
6.8.4. Фиксация и окраска белков 83
6.9. Качественное выявление углеводного, белкового и липидного компонентов в связывающей инсулин фракции сыворотки крови 85
6.9.1 .Метод определения холестерина в пробе 85
6.9.2. Метод определения триглицеридов 86
6.9.3. Определение концентрации глюкозы ферментативным методом 86
6.10. Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, связывающих инсулин 87
6.10.1 .Изучение влияния связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину 88
6.10.2. Оценка модулирующего действия хондроитинсульфата на действие инсулина на перитонеальные мышиные макрофаги in vitro 90
6.11 .Определение коэффициента распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови 93
6.12.Определение oil - кислого гликопротеина и трансферина методом нефелометрии 95
6. 13. Разработка методов синтеза аффинных сорбентов на основе гелей поливинилового спирта 96
6.13.1. Стабилизация гелей ПВС
6.13.1.1. Стабилизация гелей ПВС глутаровым альдегидом
6.13.1.2. Стабилизация гелей ПВС эпихлоргидрином
6.13.2. Синтез аффинных сорбентов на основе Поливиналя и их использование в условиях лаборатории
6.13.2.1. Оптимизация условий иммобилизации белковых лигандов на Поливинале110
6.13.2.2. Оптимизация условий проведения аффинной хрома- тографии 113
6.13.3. Испытания сорбентов на основе Поливиналя в условиях биотехнологического производства 117
6.14. Использование сорбента на основе Поливиналя с дигидроксиборильными группами для количественного определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека 135
6.14.1. Синтез и лабораторные испытания сорбента для количественного определения гликогемоглобина 136
6.14.2 Оценка достоверности и воспроизводимости количественного определения гликозилированного гемоглобина на полученном сорбенте 139
6.14.3. Исследование природы фракции гемоглобина, взаимодействующей с сорбентом Поливиналь-м-АФБК 149
6.14.4. Клинические испытания аффинного сорбента для определения гликогемоглобина в крови человека 145
6.15. Статистическая обработка экспериментальных данных 152
ЧАСТЬ 3. Результаты и обсуждение 153
Глава 7. Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. 153
7.1. Распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови. 154
7.2. Изучение распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови гормонов первой и второй групп. 157
Глава 8. Выявление, аффинное выделение и анализ гетерогенности связывающих инсулин компонентов плазмы крови 164
8.1. Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа 164
8.2. Хроматографическое выделение связывающих инсулин компонентов плазмы крови человека. 168
8.2.1. Изучение роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина и транспортных белков. 169
8.3. Спектрофотометрическое изучение связывающих инсулин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом 172
8.4. Электрофоретические спектры связывающих инсулин компонентов сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом 179
Глава 9. Структурный анализ связывающих инсулин белков плазмы крови 188
9.1. Углеводный, белковый и липидный компоненты связывающей инсулин фракции сыворотки крови
9.1.1. Особенности структуры белковой области связываю- щих инсулин компонентов плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом 189
9.1.2. Углеводный компонент инсулинсвязывающих белков крови в норме и при сахарном диабете 190
9.1.3. Липидный компонент связывающего инсулин комплекса белков крови 192
9.2. Изучение модулирующего действия инсулинсвязывающих белков крови 193
9.2.1.Влияние связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину
9.2.2. Влияние хондроэтинсульфата на эффект добавления инсулина в культуру мышиных перитонеальных макрофагов 196
Глава 10. Гормоны, входящие в состав связывающего инсулин комплекса 200
10.1. Содержание в составе связывающего инсулин комплекса гормонов первой группы 200
10.2. Гормоны второй группы, входящие в состав связывающего инсулин комплекса 201
Заключение 203
Основные выводы 230
Список литературы 232
Приложение 1 295
Приложение 2 302
Приложение 3 324
