Введение
I. Структура и функции интегразы вич-1 (обзор литературы) 10
1.1. Строение интегразы ВИЧ-1 12
1.1.1. Строение каталитического домена 13
1.1.2. Строение N-концевого домена 17
1.1.3. Строение С-концевого домена 20
1.1.4. Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы 22
1.1.5. Мультимерная организация интегразы 25
1.2. Функционирование интегразы вич-1 28
1.2.1. Реакции, катализируемые интегразой 28
1.2.2. Связывание ДНК интегразой 32
1.2.3. Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК 34
1.2.4. Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК 35
1.2.5. Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК 40
1.2.5.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата на каталитическую активность интегразы 40
1.2.5.2. Моделирование предпочтительной нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата 44 1.2.6. Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК 46
1.3. Моделирование структуры полноразмерного фермента и его комплекса с ДНК 49
ii. Интеграза вич-1: влияние структуры днк-субстрата на активность в реакции з -концевого процессинга
(Результаты и обсуждение) 53
II.1. Дизайн модифицированных аналогов ш-субстрата интегразы ВИЧ-1 54
П.2. Термическая устойчивость модифицированных аналогов ш-субстрата интегразы вич-1 59
113. Особенности выделения используемой в работе интегразы 61
Связывание интегразы с различными днк-дуплексами 62
II.4.1. Изучение связывания интегразы с ДНК методом торможения в геле 63
Н.4.2. Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции 68
И.4.3. Изучение связывания интегразы с ДНК методом фотоаффинной модификации 73
II.5. Влияние модификаций ш-субстрата на специфическую активность интегразы 78
П.5.1. Модификации нуклеозидов
в 3-ем положении Ш-субстрата 82 И.5.2. Модификации нуклеозидов
в 5-ом и 6-ом положениях Ш-субстрата 86
Н.5.3. Модификации нуклеозидов
в 7-ом и 8-ом положениях Ш-субстрата 89
Н.5.4. Модификации нуклеозидов
в 9-ом положении Ш-субстрата 94
Н.5.5. Модификации нуклеозидов
в 12-ом положении Ш-субстрата 96
П.6. Влияние Дестабилизации Днк В Районе Расщепляемой Связи На Активность Интегразы 97
П.6.1. Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями 98
П.6.1.1. Синтез субстрата интегразы
с ковалентно связанными цепями 98
П.6.1.2. Реакция 3 -концевого процессинга субстрата
с ковалентно связанными цепями 103
П.6.2. Процессинг субстратов, в которых консервативный динуклеотид
СА расположен во внутренней части дуплекса 105
П.7. Изучение контактов аденина в третьем положении процессируемой цепи ш-субстрата с интегразой 107
ІІ.8. Модель взаимодействия интегразы вич-1 с днк-субстратом 111
Экспериментальная часть 114
Ш.1. Реактивы и материалы 114 Ш.2. Методы 118
III.2.1. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК-дуплексами 120
Ш.2.2. Изучение влияния модификаций Ш-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1 123
Щ.2.3. Синтез дуплексов с ковалентно связанными цепями 124
Выводы 125
Литература
