Введение
1.Структура инсулина 6
2. Методы получения инсулина человека 7
2.1. Полный химический синтез 7
2.2. Полусинтетический 7
2.3. Биотехнологический 7
2.3.1. Двухцепочечный метод 7
2.3.2. Метод получения инсулина человека через природный предшественник ~ проинсулин 8
2.3.3. Метод получения инсулина человека через секретируемыи предшественник в дрожжах S.cerevesiae. 9
3. Физико-химические свойства инсулина 9
4. Контроль производства генно-инженерного инсулина человека 10
5. Методы контроля качества субстанции инсулина 14
5.1. Требования к чистоте и подлинности инсулина 14
5.2. Гель-фильтрация 16
5.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 17
5.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 17
5.4.1.Влияние природы ирН буферного раствора 20
5.4.2.Механизм удерживания и способ элюировапия 22
5.4.3. Природа органического модификатора 23
5.4.4. Тип стационарной фазы 24
5.4.5. Влияние температуры колонки 27
5.5. Капиллярный электрофорез 29
5.5.7. Природа и рН буферного раствора 34
5.5.2. Приложенное напряжение 37
5.5.3. Влияние типа и длины капилляра. 39
5.6. Заключение 40
6.Экспериментальная часть 43
6.2. Приготовление буферных растворов 43
6.3. Приборы и оборудование 46
6.4. Пробоподготовка и методики проведение анализов 48
7.Обсуждение результатов 56
7.1. Исследование кинетики ренатурации гибридного белка 58
7.2. Анализ чистоты гибридного белка 63
7.3. Исследование кинетики и механизма реакции трипсинолиза гибридного белка 65
7.3.1. Исследование механизма реакции трипсинолиза гибридного белка 66
7.3.2. Исследование кинетики трипсинолиза гибридного белка. 68
7.4. Подтверждение подлинности первичной структуры гибридного белка 70
7.5. Исследование процесса выделения ди-Arg -Arg -инсулина и Arg 31-инсулина из реакционной массы 73
7.6.Исследование кинетики расщепления ди-Arg -Arg -инсулина карбоксипептидазой В 75
7.7. Анализ чистоты инсулина и оценка эффективности его очистки методом ионообменной хроматографии 79
7.8.Идентификация примесей в ГИИЧ 81
7.8.1.Определение содержания de3-OMudo-AsnA2 -инсулина. 81
7.8.2. Определение содержания ди-Arg -Arg -инсулина, Arg - инсулина и дез-амидо-АтА2і-инсулина 83
7.8.3.Определение содержания дез-амидо-Asn -инсулина методом ОФВЭЖХ. 85
7.8.4.Определение содержания дез-амидо-инсулинов методом .КЭФ...88
7.8.5.Определение содержания дез-Т1ігЮ0-инсулина 89
7.9.Подтверждение подлинности первичной структуры инсулина 93
7.10. Пептидное картирование производных инсулина методом капиллярного электрофореза 101
Выводы 103
Список литературы 104
