Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структурно-функциональная характеристика клеток крови человека 16
1.1.1. Характеристика лимфоцитов крови человека, особенности их строения и метаболизма 16
1.1.2. Характеристика эритроцитов крови человека, особенности их строения и метаболизма 23
1.2. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы 27
1.2.1. Структура, физико-химические свойства и функции CD95 (Fas/APO-1) рецепторов 32
1.2.2. Регуляция апоптоза антиапоптозными белками и цитокинами 33
1.3. Краткая характеристика УФ-излучения и его воздействие на клетки крови человека 39
1.4. Монооксид углерода - внутриклеточный газовый посредник 44
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1. Объект исследования 56
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение лимфоцитов из крови доноров методом седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина 56
2.2.2. Выделение эритроцитов из гепаринизированной крови доноров 57
2.2.3. Генерация монооксида углерода лабораторным методом 57
2.2.4. Определение концентрации монооксида углерода в эксперименте 57
2.2.5. Определение активности ионов водорода (рН) буферного раствора Хенкса в процессе инкубации нативных и СО-модифицированных лимфоцитов крови человека 58
2.2.6. Облучение УФ-светом суспензии лимфоцитов крови человека 59
2.2.7. Модификация лимфоцитов крови человека блокаторами синтеза белка (циклогексимидом и анизомицином) и рекомбинантным интерлейкином-2 59
2.2.8. Исследование жизнеспособности лимфоцитов крови человека 60
2.2.9. Исследование уровня экспрессии некоторых мембранных маркеров на поверхности лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа 2.2.10. Исследование уровня экспрессии CD95 рецептора на поверхности мембран лимфоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии 62
2.2.11. Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов крови человека 64
2.2.12. Выделение ДНК из лимфоцитов крови человека 65
2.2.13. Анализ образцов ДНК с помощью метода горизонтального электрофореза в геле 67
2.2.14. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов крови человека 69
2.2.15. Выделение митохондрий из лимфоцитов крови человека 69
2.2.16. Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриях лимфоцитов крови человека 70
2.2.17. Определение активности цитохром с оксидазы в митохондриях лимфоцитов крови человека 71
2.2.18. Приготовление гемолизатов эритроцитов крови человека по методу 72 Драбкина
2.2.19. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в гемолизате эритроцитов крови человека 72
2.2.20. Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ пр. и ЛДГ обр.) в гемолизате эритроцитов крови человека и расчет коэффициента баланса энергетических реакций 73
2.2.21. Определение содержания антиапоптозного белка Вс1-2 в лизате
лимфоцитов крови человека 75
2.2.22. Определение содержания антиапоптозного белка сурвивина в лизате лимфоцитов крови человека 77
2.2.23. Статистическая обработка результатов 79
Глава 3. Исследование воздействия монооксида углерода на лимфоциты крови человека
3.1. Определение жизнеспособности СО-модифицированных (5-ИЮ мин.) лимфоцитов крови человека до и после суточного термостатирования 80
3.2. Исследование влияния монооксида углерода (5-ИЮ мин.) на изменение активности ионов водорода (рН) в растворе Хенкса лимфоцитов крови человека 81
3.3. Исследование влияния монооксида углерода (5-ИЮ мин.) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа 83
3.3.1. Изучение влияния блокаторов синтеза белка на уровень экспрессии CD95 рецептора СО-модифицированных лимфоцитов крови человека 86
3.4. Исследование влияния монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии 89
3.5. Исследование влияния монооксида углерода (5-ИЮ мин.) на уровень экспрессии CD8 рецепторов лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа до и после суточного термостатирования 91
3.6. Исследование структурного состояния молекул ДНК лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после суточного термостатирования 94
3.7. Исследование люминолзависимой биохемилюминесценции лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования 95
3.8. Исследование активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования 98
3.9. Исследование активности цитохром с оксидазы митохондрий лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования 100
3.10. Исследование содержания антиапоптозного белка Вс1-2 в лизате лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования 101
3.11. Исследование содержания Вс1-2 лимфоцитов крови человека после комплексного действия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) и рекомбинантного интерлейкина-2 методом иммуно ферментного анализа 103
3.12. Исследование содержания антиапоптозного белка сурвивина в лизате лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования 104
3.13. Исследование содержания антиапоптозного белка сурвивина лимфоцитов крови человека после сочетанного действия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) и рекомбинантного интерлейкина-2методом 105
иммуноферментного анализа
Глава 4. Исследование влияния монооксида углерода на эритроциты крови человека 107
4.1. Исследование влияния монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на поверхностную архитектонику эритроцитов крови человека методом сканирующей электронной микроскопии 107
4.2. Исследование влияния монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на энергетический метаболизм эритроцитов крови человека
4.2.1. Исследование активности лактатдегирогеназы в прямой и обратной реакции после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на эритроциты крови человека 113
4.2.2. Исследование активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на эритроциты крови человека 116
Глава 5. Исследование воздействия уф-света на лимфоциты крови человека 118
5.1. Исследование воздействия УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии 118
5.2. Исследование воздействия УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) на структурное состояние ДНК лимфоцитов крови человека методом электрофореза в агарозном геле до и после их суточного термостатирования 120
5.3. Исследование люминолзависимой биохемилюминесценции лимфоцитов крови человека после воздействия УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м ) до и после их суточного термостатирования 122
5.4. Исследование активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови человека после воздействияУФ-света (151, 453 и
755 Дж/м ) до и после их суточного термостатирования 124
5.5. Исследование активности цитохром с оксидазы митохондрий лимфоцитов крови человека после воздействияУФ-света 755 Дж/м )до и после их суточного термостатирования 126
5.6. Исследование содержания антиапоптозного белка Вс1-2 лимфоцитов крови человека после воздействия УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м ) до и после их суточного термостатирования 127
5.7. Исследование содержания антиапоптозного белка сурвивина лимфоцитов крови человека после воздействия УФ-света (151, 453 и 55 Дж/м ) до и после их суточного термостатирования 129
Глава 6. Исследование комплексного воздействия монооксида углерода и уф-света на лимфоциты крови человека 131
6.1. Исследование комплексного воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом проточной цито флуориметрии 131
6.2. Исследование комплексного воздействия монооксида углерода (60, 75
и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) на структурное состояние ДНК лимфоцитов крови человека методом электрофореза в агарозном геле до и после их суточного термостатирования 134
6.3. Исследование люминолзависимой биохемилюминесценции лимфоцитов крови человека после комплексного воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) до и после их суточного термостатирования 137
6.4. Исследование активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий лимфоцитов крови человека после комплексного воздействия монооксида углерода (60,75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) до и после их суточного термостатирования 141
6.5. Исследование активности цитохром с оксидазы митохондрий лимфоцитов крови человека после комплексного воздействия монооксида углерода (60,75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) до и после их суточного термостатирования 143
6.6. Исследование содержания антиапоптозного белка Вс1-2 лимфоцитов крови человека после комплексного воздействия монооксида углерода (60,
75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) до и после их суточного 145
термостатирования
6.7. Исследование содержания антиапоптозного белка сурвивина лимфоцитов крови человека после комплексного воздействия моноксида углерода (60, 75 и 90 мин.) и УФ-света (151, 453 и 755 Дж/м2) до и после их 148
суточного термостатирования
Заключение 150
Выводы 157
Список литературы
