Введение
Глава 1. Современные представления о липолитических ферментах 9
1.1. Характеристика продуцентов и физико-химические свойства липаз 9
1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз 13
1.3. Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека 21
Глава 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических ферментов 25
2.1. Методы иммобилизации липаз 25
2.2. Физико-химические аспекты катализа иммобилизованными ферментами 32
2.3. Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях 37
Глава 3. Объекты и методы исследования 40
3.1. Объект исследования 40
3.2. Методы исследования 40
3.2.1. Выделение препарата липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403 40
3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии 41
3.2.3. Ионообменная хроматография на колонке с диэтиламиноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой) 42
3.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури 43
3.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментых препаратах модифицированным методом Лоури 44
3.2.6. Спектрофотометрический метод определения каталитической активности липазы 45
3.2.7. Подготовка ионитов АВ-26 и АВ-17-2П к иммобилизации 46
3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации липазы 47
3.2.9. Методика ковалентной иммобилизации липазы с помощью глутарового альдегида 48
3.2.10. Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-спектрофотометрии (ИКС) 48
3.2.11 Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле 51
3.2.12. Метод визуализации пространственной структуры белковых молекул на базе программы MolScript 52
3.2.13. Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого 53
3.2.14. Статистическая обработка результатов экспериментов 54
Глава 4. Вьщеление, очистка, физико-химические свойства препарата липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55
4.1. Изучение условий выделения и очистки липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55
4.2. Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus 1403 64
Глава 5. Исследование особенностей строения активного центра ли пазы Rhizopus japonicus 68
5.1. Идентификация имидазольной группы гистидина в каталитическом центре молекулы липазы Rhizopus japonicus 68
5.2. Воздействие фенилметилсульфонилфторида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 74
5.3. Воздействие дициклогексилкарбодииимида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 79
5.4. Исследование роли ионов двухвалентных металлов в функционировании липазы Rhizopus j aponicus 82
Глава 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы Rhizopus j aponicus 1403 88
6.1. Воздействие додецилсульфоната натрия на состояние четвертичной структуры липазы 88
6.2. Исследование особенностей вторичной структуры субъединиц липазы методом ИК-спектрофотометрии 92
6.3. Модификация липазы бифункциональными реагентами 95
6.4. Визуализация олигомерной структуры липазы Rhizopus j aponicus 1403 методом атомно-силовой микроскопии 96
Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из Rhizopus japonicus 1403 на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом 101
7.1. Исследование условий иммобилизации липазы на некоторых ионо обменных смолах 101
7.2. Некоторые физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободной и иммобилизованной липазой 106
7.3. Исследование технологических характеристик реакции гидролиза триглицеридов липазой, иммобилизованной на анионите АВ-17-2П 114
Глава 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного гидролиза триглицеридов 118
Заключение 130
Выводы 134
Список литературы 136
