Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Ген р53 и его связь с развитием опухолей 9
1.1.1. р53: история изучения 9
1.1.2. Молекулярная организация гена и белка р53 10
1.1.3. Мутации гена р53 при канцерогенезе и в опухолях 14
1.1.4. Функции белка р53 и последствия их нарушения при канцерогенезе 18
1.2. Характеристика «гуманизированной» линии генетически модифицированных мышей Hupki, содержащих экзоны (с 4-го по 9-й) гена 53 человека 23
1.3. Аристолохиевая кислота - генотоксическии и канцерогенный эффект 26
1.4. Заключение 30
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Получение гомозиготной HupkiPro/Pro и гетерозиготной HupkiArg/Pro линий мышей 32
2.2. Генотипирование мышей Hupki 34
2.2.1. Получение геномной ДНК 34
2.2.2. Генотипирование мышей Hupki и мышей дикого типа 129Sv посредством ПЦР с двумя наборами праймеров 34
2.2.3. Генотипирование и определение полиморфизма 72-го кодона аллелей гена р53 мышей Hupki с помощью рестрикционных энзимов 36
2.2.4. Генотипирование мышей Hupki по аллелям гена р53 человека с помощью ПЦР и секвенирования 38
2.3. Получение первичных фибробластов эмбрионов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro, а также иммортализованных клеточных линий 39
2.4. Инкубация первичных культур фибробластов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro с аристолохиевой кислотой 40
2.5. Схема эксперимента 42
2.6. Определение аддуктов ДНК 43
2.7. Анализ мутаций гена р53 45
2.8. Определение делеции экзонов гена р19- ARF в иммортализованных клеточных линиях мышей Hupki 46
2.9. Определение присутствия белков р53 и р19-ARF в фибробластах гуманизированных мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro 47
2.9.1. Электрофорез белков 47
2.9.2. Иммуноблоттинг 48
2.10. Статистический анализ 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Характеристика полученных линий мышей Hupki, эмбрионов мышей и первичных культур эмбриональных фибробластов 49
3.2. Рост эмбриональных фибробластов мышей Hupki в культуре и влияние на него аристолохиевой кислоты 52
3.3. Характеристика аддуктов ДНК, образующихся после инкубации первичных культур эмбриональных фибробластов с аристолохиевой кислотой 56
3.4. Характеристика спонтанных мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9) в контрольных клеточных линиях мышей Hupki 58
3.5. Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в мбриональных фибробластах мышей HupkiArg/Pro " 62
3.6. Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в эмбриональных фибробластах мышей HupkiPro/Pro 66
3.7. Сравнение мутагенного эффекта аристолохиевой кислоты в гомозиготных и гетерозиготных фибробластах мышей Hupki 71
3.8. Делеции гена p19-ARF в контрольных и экспериментальных клеточных линиях эмбриональных фибробластов мышей Hupki 72
3.9. Исследование присутствия белков р53 и p19-ARF в полученных клеточных линиях фибробластов мышей Hupki 75
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 81
Выводы 90
Список литературы 92
