Введение
Глава 1. Наследственные нейродегенеративные заболевания 12
1.1 Генная терапия в лечении нейродегенеративных заболеваний 12
1.1 Болезнь Альцгеймера 16
1.2 Болезнь Паркинсона 20
1.4 Нейродегенеративные заболевания, связанные с удлинением полиглутаминового фрагмента 25
Глава 2. Болезнь Хантингтона 30
2.1 Распространенность и клинические проявления болезни Хантингтона 30
2.2 Структура и функции хантингтина 34
2.3 Взаимодействие хантингтина с факторами транскрипции 37
2.4 Клеточная модель патогенеза болезни Хантингтона 40
2.5 Подходы к лечению болезни Хантингтона 43
Глава 3. Потенциальные механизмы токсичности хантингтина: факты и гипотезы 46
3.1 Образование агрегатов и токсичность 46
3.2 Инактивация транскрипционных факторов 48
3.3 Протеасомный стресс и регуляция клеточного цикла 50
Глава 4. Использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модели для изучения токсичности полиглутаминов 52
4.1 Дрожжи как экспериментальная модель для изучения программируемой клеточной гибели 52
4.2 Моделирование агрегации и токсичности полиглутаминов на дрожжах 54
4.3 Преимущества и ограничения дрожжевой модели 56
Материалы и методы исследования 59
Глава 1. Материалы исследования 59
1.1 Генотипы использованных штаммов дрожжей 59
1.2 Генотипы использованных штаммов бактерий 61
1.3 Генетические конструкции, плазмиды 61
1.4 Реактивы, ферменты, буферы 64
Глава 2. Культивирование дрожжей 65
2.1 Условия культивирования 65
2.2 Среды для культивирования 65
2.3 Оценка выживания по КОЕ 67
Глава 3. Микроскопия 68
3.1 Оценка выживания по окрашиванию клеток 68
3.2 Окрашивание клеток на ДНК. 68
Глава 4. Биохимические методы 69
4.1 Экстракция белков из дрожжевых клеток 69
4.2 Электрофоретическое разделение белков в ПААГ 69
4.3 Оценка уровня карбонилирования белков 70
4.4 Измерение скорости поглощения кислорода 71
Глава 5. Молекулярно-биологические методы 72
5.1 Выделение геномной ДНК из дрожжей 72
5.2 Выделение плазмидной ДНК из бактерий 72
5.3 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК 73
5.4 Выделение ДНК из агарозного геля 73
5.5 Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 74
5.6 Реакция дефосфорилирования 74
5.7 Реакция лигирования 74
5.8 Полимеразная цепная реакция 75
5.9 Трансформация бактериальных клеток 77
5.10 Трансформация дрожжей 78
5.11 Секвенирование 80
Глава 6. Комплексные методики 81
6.1 Получение мутантных линий с полностью инактивированным геном 81
6.2 Общая схема генетического скрининга 82
Результаты 85
Глава 1. Исследование токсических свойств полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели 85
Глава 2. Исследование агрегации полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели 88
Глава 3. Исследование программируемой клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 91
3.1 Признаки программируемой клеточной гибели, детектируемые при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах 91
3.2 Влияние антиоксидантов на выживаемость и колониеобразующие свойства дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина 95
Глава 4. Исследование функции гена YCA1 98
4.1 Влияние гена YCA1 на ядерную локализацию агрегатов полиглутаминового фрагмента хантингтина 98
4.2 Оценка уровня карбонилированных белков в штаммах, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент 100
4.3 Влияние гена YCA1 на выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина 101
4.4 Влияние экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина и гена YCA1 на клеточный цикл 104
Глава 5. Скрининг генов, вовлеченных в проявление токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 108
5.1 Описание скрининга 108
5.2 Результаты скрининга 109
5.3 Анализ полученных мутантов на устойчивость к экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 112
Глава 6. Исследование функции гена ASE1 116
Глава 7. Исследование функции генов CDH1 и CLB2 118
Обсуждение 123
Выводы 128
Список работ, опубликованных по теме диссертации 129
Список использованной литературы 130
