Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1. Активация яйца 10
1.1. Возможные способы активации яйца рыб 11
1.2. Спонтанная активация яйца рыб . 12
1.3. Искусственная активация яйца рыб 14
1.4. Активация яйца при гиногенезе у рыб 15
2. Сохранение яйцом способности к оплодотворению в разных условиях 16
2.1. Происхождение полостной жидкости у рыб 18
2.2. Состав полостной жидкости у рыб 19
2.3. Функции полостной жидкости у рыб 20
2.4. Изучение влияния ингибиторов протеаз на процесс активации и оплодотворения 21
3. Особенности организации кортикального слоя зрелого яйца рыб .. 26
3.1. Строение неоплодотворенного яйца медаки 26
3.2. Строение неоплодотворенного яйца данио 27
3.3. Кортикальные гранулы рыб 28
3.3.1. Строение и состав кортикальных гранул рыб 29
3.3.2. Образование кортикальных гранул в ооцитах рыб 31
4. Общие закономерности экзоцитоза кортикальных гранул в яйце 31
4.1. Экзоцитоз кортикальных гранул у осетровых рыб 33
4.2. Особенности экзоцитоза кортикальных гранул у костистых рыб 34
5. Роль экзоцитоза кортикальных гранул в блокировании полиспермии 36
5.1. Полиспермия как следствие замедления и подавления экзоцитоза кортикальных гранул 38
6. Роль подмембранного цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул 39
7. Участие ионов кальция в процессе активации яйца 40
7.1. Источники ионов кальция и механизмы его высвобождения 41
7.2. Са - зависимые сигнальные процессы активации яйца 42
7.3. Особенности распространения волны кальция на примере костистых рыб: медаки (Oryzias latipes) и данио (Brachydanio rerio) 43
7.3.1. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце медаки 44
7.3.2. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце данио 44
8. Участие ионов кальция в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул 47
8.1. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул у рыб 48
9. Влияние форболовых эфиров на экзоцитоз кортикальных гранул ... 51
10. Кальцийсвязывающие белки 54
10.1. EF-hand белки 54
10.1.1. Кальмодулин 55
10.1.2. S-100 белки 55
10.2. Аннексины 55
10.3. С2 — кальцийсвязывающие белки 58
Глава II. Материалы и методы 59
1. Объекты исследований. Способы получения половых продуктов.. 59
2. Выделение и очистка смеси аннексинов из зрелых яиц вьюна 60
3. Выделение и очистка аннексинов из зрелых яиц данио 61
4. Масс-спектрометрический анализ белков, выделенных из ооцитов данио 61
5. Иммунизация лабораторных животных 61
6. Выделение и очистка поликлональных антител к белку 31кДа 62
7. Иммунологический анализ материала яиц вьюна и данио 64
8. Иммунологический анализ образцов различных тканей вьюна 64
9. Получение Зл- концевой нуклеотидной последовательности аннексинаЗІ кДа 64
10. Определение размеров мРНК аннексина 31 кДа данио 65
11. Получение 5"-концевой нуклеотидной последовательности аннексинаЗІ кДа данио 65
12. Получение 5" -концевых последовательностей кДНК аннексинов А13.1,А13.2иАЗ данио 66
13. Получение полноразмерньгх кДНК аннексинов А13.1 и А13і2 67
14. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2 68 .
15. Микроинъекции 69
16. Световая и электронная микроскопия 70
17. Определение количества актина в яйце вьюна 70
Глава III. Результаты 71
1. Влияние ионов кальция и фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна 71
1.1. Строение кортикального слоя яйца вьюна и экзоцитоз кортикальных гранул 71
1.2. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна 76
1.3. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул 78
2. Влияние сред различного состава на спонтанную активацию яйца вьюна и данио 82
2.1. Изучение влияния сред разного состава на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио 83
2.2. Влияние лейпептина и апротинина- ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению 84
2.3. Влияние форболовых эфиров на активацию яиц вьюна и данио 89
3. Идентификация кальцийсвязьівающих белков, присутствующих в
ооцитах данио и яйцеклетках вьюна 91
3.1. Выделение белков группы аннексинов из яиц рыб 91
3.2. Получение моноспецифических поликлональных антител к белку 31 кДа вьюна 93
3.3 Исследование распределения белка ЗІкДа в разных тканях вьюна 96
3.4. Получение и анализ кДНК, содержащей полноразмерную кодирующую последовательность белка с молекулярной массой 31 кДа данио 97
3.5. Идентификация аннексинов, выделенных из ооцитов данио. 102
3.6. Идентификация в ооцитах данио копина Ш 107
3.7. мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио 108
3.8. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2 113
Обсуждение 114
Заключение 126
Выводы 128
Список сокращений 129
Благодарности 130
Список литературы
