Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на
экспрессию генов 11
1.1.1 Гистоны и метилирование ДНК 12
1.1.2 Петли хроматина и метилирование ДНК 13
1.1.3 Метилирование при импринтинге 14
1.1.4 Регуляторные белки CTCF и KAISO 16
1.1.5 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием. 17
1.2 Изменения уровня метилирования при различных патологиях 19
1.2.1 Гипометилирование ДНК 20
1.2.1.1 Активация онкогенов 21
1.2.1.2 Метилирование мобильных элементов 22
1.2.1.3 Хромосомная нестабильность 24
1.2.3 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций 26
1.3 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических TATA-последовательностей 28
1.3.1 Основные свойства инициаторного элемента (inr) 31
1.3.2 DPE элемент промотора (downstream promotor element) 33
1.3.3 Проксимальный (pse) и дистальный (dse) промоторые элементы 35
1.3.4 МТБ элемент (motif ten element) 36
1.3.5 DCE элемент (downstream core element) 36
1.3.6 Элементы, специфические для he содержащих тата-последовательность промоторов 37
1.3.7 cpg островки 38
1.3.8 частные случаи регуляции генов не содержащих тата-последовательность.39
1.3.8.1 Регуляция транскрипции генов NKR-P1 семейства 39
1.3.8.1.1 Структура промотора гена Ly49 и тканеспецифичность экспрессии 40
1.3.8.1.2 Особенности гена KLRB1 42
1.3.8.2 Регуляция транскрипции гена PROM1 43
ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение 48
2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов klrb1 и prom1 48
2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях 48
2.1.2 Транскрипция в эмбриональном легком человека 49
2.1.3 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода 50
2.1.4 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5-областях генов PROM1 и KLRB1 54
2.1.4.1 5-RACE гена KLRB1 55
2.1.4.2 Транскрипция изоформ гена PROM1, отличающихся по содержанию экзона 4 58
2.1.4.3 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 иР2 58
2.2 Определение статуса метилирования участков генов prom1 и KLRB1 59
2.2.1 Использование деметилирующего агента 5-Аза 59
2.2.2 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена PROM1 61
2.2.2.1 Метилирование промотора Р1 63
2.2.2.2 Метилирование промотора Р2 65
2.4.2.1 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2 66
2.2.3 Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР 67
2.2.4 Метилирование и транскрипция 68
2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1. 71
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 73
3.1 Материалы 73
3.1.1 Ферменты и реактивы 73
3.1.2 Оборудование 73
3.1.3 Расходные материалы 74
3.1.4 Буферные и другие растворы 74
3.1.5 Микробиологические среды 74
3.1.6 Клеточные линии 75
3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов 75
3.2 Методы исследования 77
3.2.1 выделение рнк и геномной днк 77
3.2.1.1 Выделение РНК 77
3.2.1.2 Определение концентрации РНК 77
3.2.1.3 Анализ вьщеленной РНК методом гель электрофореза 77
3.2.1.4 Выделение геномной ДНК 78
3.2.1.5 Высаживание 78
3.2.2 Обработка днказой 78
3.2.3 Синтез первой цепи КДНК 78
3.2.3.1 Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР 78
3.2.3.2 Контроль на наличие примесей ДНК, "-ОТ" контроль 79
3.2.3.3 Построение первых цепей кДНК для 5-RACE 79
3.2.4 ПЦР 79
3.2.4.1 ОТ-ПЦР 79
3.2.4.2 Геномная ПЦР 80
3.2.4.3 Электрофорез 80
3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и ПЦР фрагментов 80
3.2.6 нуклЕотидные последовательности и их анализ 80
3.2.7 Бисульфитное секвенирование 81
3.2.7.1 Секвенирование CG-богатых областей генов PROM1 и KLRB1 81
3.2.7.2 Секвенирование промоторного участка гена PROM1 81
3.2.8 Молекулярное клонирование 82
3.2.8.1 Лигирование 82
3.2.8.2 Клонирование 83
3.2.8.3 Трансформация 83
3.2.8.4 Выращивание ночной культуры клеток 83
Выводы: 84
Список литературы: 85
