Введение
1. Обзор литературы
1.1. Липополисахариды, структура и биологическая активность 10
1.2. Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку 16
1.3.ЛПС-зависимое праймирование нейтрофилов 24
1.3.1. Изменение цитоскелета клетки 24
1.3.2. Реорганизация микрофиламентов цитоскелета 27
1.3.3. TLR4-onocpedoeaHHbiu фагоцитоз 29
1 ANADPH-оксидазный комплекс и роль праймирования в его сборке. 32
1.4.1. Сборка NADPH-оксидазного комплекса 34
1.4.2. Рецептор-опосредуемая продукция АФК 37
1.5. Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов 38
1.6. Активация клеток приобретенного иммунитета ЛПС 42
Приложение Промономиелоцитарная линия клеток ТНР-1 43
2. Материалы и методы исследования .
2.1 .Материалы 47
2.2.Объекты исследования 47
2.3.Получение ЛПС из Rhodobacter capsulatus 48
2.3.1. Очистка ЛПС 49
2.3.2. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза в вертикальном пластинчатом геле по Крауссе [KraussetaL, 1988] 49
2.3.3. Определение ЛПС по реакции с карбоцианиновым красителем 50
2.3.4. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2- тиобарбитуровой кислотой 51
2.4.Культивирование бактерий Е. coli К12 52
2.4.1. Получение FITC-меченых клеток Е. coli К12 52
2.5.Выделение мононуклеаров и нейтрофилов из периферической крови человека 53
2.6.Праймирование нейтрофилов липополисахаридами 54
2.6.1. Регистрация образования активных форм кислорода (АФК) хемилюминесценцентным методом 54
2.6.2. Регистрация образования АФК хемилюминесценцентным методом в условиях подавленной сборки цитоскелета 55
2.7.Проведение реакции фагоцитоза с FITC-мечеными клетками Е. coli К12 56
2.8.Дифференцировка и активация ТНР-1 клеток 56
2.9,Определение концентрации TNF-a и IL-6 в пробах 57
2.10. Оценка экспрессии рецепторов на моноцитах и ТНР-1 клетках методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания 58
2.11. Определение синтетической активности лимфоцитов методом микроспектрального флуоресцентного анализа 58
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Исследование влияния структуры эндотоксинов на праймирование нейтрофилов по оценке уровня дыхательного взрыва 60
3.2.Влияние цитохалазина на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов 69
3.3.Исследование функциональных ответов дифференцированных ТНР-1 клеток на ЛПС разной структуры 77
3.3.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности ТНР-1 клеток 77
3.3.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов TNF-a и IL-6 дифференцированными ТНР-1 клетками 80
3.4.Исследование функциональных ответов фагоцитов на ЛПС разной структуры 84
3.4.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека 84
3.4.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов TNF-a, IL-6 мононуклеарами крови человека 88
3.6..Влияние структуры ЛПС на синтетическую активность лимфоцитов человека 91
Выводы 96
Список литературы 97
