Введение
3. Обзор литературы 12
3.1. Клеточная адгезия 12
3.1.1. Внеклеточный матрикс (ВКМ) 12
3.1.2. Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы 13
3.1.3. Фокальная адгезия 16
3.1.4. Актиновый цитоскелет (АЦ) 18
3.1.4.1. Формирование актиновых структур в процессе распластывания клетки на субстрате 20
3.1.4.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур 22
3.2. Внутриклеточная сигнализация 24
3.2.1. Внеклеточные сигнальные молекулы и их рецепторы 24
3.2.1.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор (ЭФР-Р) 25
3.2.2. Основные пути проведения сигнала в клетке, активируемые ЭФР 26
3.2.3. Транскрипционные факторы (ТФ)ОТкВ, SRF и API 28
3.2.3.1. NFKB 28
3.2.3.2. SRF 31
3.2.3.3. API 32
3.2.3.4. Активация NFKB, SRF и API эпидермальным фактором роста 33
3.2.3.5. Малые ГТФ-азы семейства Rho 34
3.2.3.6. Активация NFKB, SRF и АРІ в результате возбуждения интегриновых рецепторов 35
3.3. Участие актинового цитоскелета в проведении сигнала..36
3.3.1. Мембранный уровень сигнализации 36
3.3.2. Цитоплазматический уровень сигнализации 38
3.3.3. Ядерный уровень сигнализации 42
3.3.3.1. Ядерно-цитоплазматический транспорт 42
3.3.3.2. Участие актина в ядерных событиях 43
3.4. Заключение 44
4. Материалы и методы исследования 47
4.1. Получение ламинина 2/4 47
4.2. Получение фибронектина 48
4.3. Получение моноклональных антител 5а9 к рецептору эфр 48
4.4. Разделение белков в системе диск-электрофореза 50
4.5. Культивирование клеток 50
4.6. Подготовка субстратов 51
4.7. Распластывание клеток на субстратах 51
4.8. Изучение структуры актинового цитоскелета 53
4.9. Изучение перераспределений в клетке р65 и винкулина 53
4.10. Антитела 54
4.11. Получение ядерных экстрактов 54
4.12. Выявление днк-связывающей активности траникрипционных факторов 55
4.13. Количественный анализ днк-связывающей активности тф
56
5. Результаты 59
5.1. Реорганизации актинового цитоскелета при взаимодействии клеток а431 с иммобилизованными лигандами в Течение 24 4 59
5.2. Взаимодействие транскрипционных факторов с консенсутными последовательностями ДНК 64
5.2.1. Конкурентный анализ транскрипционных факторов 64
5.2.2. Исследование изменений ДНК-связывающей активности ТФ после перестроек АЦ, вызванных переводом клеток в суспензионное состояние, и культивированием на лигандах в течение 1 ч 66
5.3. Уточнение сроков исследования 67
5.4. Анализ динамики ац и активности тф в процессе распластывания клеток (ДО 2 Ч) 69
5.4.1. Распластывание клеток на фибронектине 69
5.4.1.1. Анализ формирования АЦ при распластывании клеток 69
5.4.1.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ 72
5.4.2. Распластывание клеток на ламинине 2/4 76
5.4.3. Распластывание клеток на антителах 5А9 к рецептору ЭФР 79
5.5. Исследование распределений винкулина при распластывании клеток на фибронектине или ламинине 2/4 82
5.5.1. Распределение винкулина в процессе распластывания клеток на ФН 84
5.5.2. Распределение винкулина в процессе распластывания клеток на ЛМ 84
5.6. Анализ перестроек ац и активности тф при воздействии на распластанные клетки ЭФР 85
5.6.1. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ в клетках, распластанных на ФН .85
5.6.1.1. Анализ динамики АЦ 85
5.6.1.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ 88
5.6.2. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, распластанные на ЛМ 93
5.6.3. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, распластанные на AT 96
5.6.4. Исследование перераспределений винкулина под действием ЭФР на
распластанные на ФН и ЛМ клетки 100
5.6.4.1. Распределение винкулина в клетках, распластанных на ФН 100
5.6.4.2. Распределение винкулина в клетках, распластанных на ЛМ 102
5.7. Анализ динамики ац и активности тф при последовательном воздействии на распластанные клетки цитохалазщиномдиэфр 102
5.7.1. Исследование ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, выращенных на пластике 105
5.7.2. Сравнительный анализ ДНК-связывающей активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, выращенные на пластике и на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 108
5.7.2.1. Сравнение изменений ДНК-связывающей активности NFKB клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах и клеток, выращенных на пластике 110
5.7.2.2. Сравнение изменений ДНК-связывающей активности SRF клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах и клеток, выращенных на пластике 112
5.7.3. Анализ активности ТФ при последовательном воздействии цитохалазином Д и ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 112
5.7.3.1. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на ФН клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 115
5.7.3.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на ЛМ клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 115
5.7.3.3. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на AT клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 117
5.7.4. Анализ реорганизаций АЦ при последовательном воздействии цитохалазином Д и ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 118
5.7.4.1. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на ФН 119
5.7.4.2. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на ЛМ 123
5.7.4.3. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на AT 126
5.7.5. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня
ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на иммобилизованных
лигандах и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 127
5.7.5.1. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на ФН и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 128
5.7.5.2. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на ЛМ или AT и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 129
5.8. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы Р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB 131
5.8.1. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня
ДНК-связывающей активности NFKB при распластывании клеток 132
5.8.1.1. Распластывание клеток на фибронектине 132
5.8.1.2. Распластывание клеток на ламинине 2/4 134
5.8.1.3. Распластывание клеток на антителах к рецептору ЭФР 135
5.8.2. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB при обработке ЭФР клеток, распластанных на разных лигандах 137
5.8.3. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB при последовательной обработке цитохалазином Д и ЭФР клеток, распластанных на разных лигандах 142
6. Обсуждение результатов 145
7. Выводы 160
8. Список работ, опубликованных по теме диссертации 162
9. Список использованной литературы
