Введение
ГЛАВА 1. Почва как среда обитания микроорганизмов 8
ГЛАВА 2. Методы исследования сообществ почвенных микроорганизмов 10
2.1. Традиционные микробиологические методы исследования 10
2.1.1. Методы иммунодиагностики 10
2.2. Молекулярные методы исследования сообществ. .11
2.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК 12
2.2.2. ДНК реассоциация 12
2.2.3. Методы на основе секвенирования нуклеиновых кислот 13
2.2.4. Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦР-анализа 15
2.2.4.1. ГГЕ-анализ. 15
2.2.4.2. Молекулярный фингерпринтинг на основе рестриктазной обработки фрагментов. 17
2.2.4.3. Модификации ПЦР-анализа со специфичными зондами и праймерами. 17
2.2.4.4. ПЦР со случайными праймерами 18
2.2.5. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот 19
2.3 Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований. .20
2.3.1. Выделение ДНК 20
2.3.2. Ограничения ПЦР анализа 22
2.3.3. Ограничения использования ДГЕ-анализа 23
2.3.4. Ограничения рестрикционного анализа 23
2.3.5. Ограничения методов In situ гибридизации 24
2.4. Системный подход в исследованиях микробных сообществ. 24
2.4.1. Анализ состава жирных кислот 26
2.4.2. Определение физиологического профиля сообщества (Biolog) 26
2.4.3. Анализ проб со стабильными изотопами 27
2.4.4. Методы клонирования тотального генома сообщества 28
2.4.5. Анализ функциональных генов 28
ГЛАВА 3. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов 30
3.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота . 30
3.2. Строение и регуляция нитрогеназного комплекса 31
3.3. Гены нитрогеназного комплекса. 34
3.4. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов в природных экосистемах. 37
3.5. Краткая характеристика аноксигенных фотосинтезирующих микроорганизмов. 43
3.6. Некоторые аспекты проблемы фиксации азота в болотных экосистемах.. 46
Заключение 48
Объекты и методы исследования 50
1. Объекты исследования 50
2. Получение препаратов ДНК 54
2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов. 54
2.2 Получение препаратов ДНК из почвенных образцов. 54
2.2.1. Прямая экстракция нуклеиновых кислот из почвенных образцов 54
2.2.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов через стадию выделения бактериальных клеток 57
3. ПЦР-амплификация 59
3.1. Амплификация генов 16S рРНК. 59
3.2. ПЦР со специфичными праймерами к гену nifH. 59
4. Очистка фрагментов пцр в агарозе 60
5. Клонирование пцр-фрагментов 60
5.1. Приготовление компетентных клеток . 60
5.2. Лигирование. 61
5.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК. 62
5.4. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК. 63
5.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК. 63
6. Секвенирование 63
6.1. Мечение праймеров. 63
6.2. Постановка реакции секвенирования и форез. 64
7. Анализ полученных последовательностей 64
Результаты и обсуждение 66
1 Разработка экспресс-метода выделения днк из почвенных образцов 66
1.1. Метод прямой экстракции нуклеиновых кислот из почвенного образца 66
1.2. Получение препаратов ДНК через стадию выделения фракции бактериальных клеток . . 70
2. Изучение последовательностей генов /v/fh различных представителей аноксигенных фототрофов и близких к ним микроорганизмов 80
2.1. Выявление и анализ последовательностей фрагментов генов nifH у аноксигенных фототрофных микроорганизмов. 81
2.2. BLAST-анализ полученных последовательностей генов nifH. 82
3. Сравнение молекулярных, серологических и микроскопических методов для характеристики микробных сообществ 103
3.1. Микроскопический и серологический анализ. 104
3.2. Молекулярный анализ 106
4. Анализ диазотрофного сообщества кислой торфяной почвы сфагнового
Верхового болота 112
Выводы: 127
Список литературы
