Введение
1. Рекомбинантные а-интерфероны человека: продукция и пути усовершенствования (обзор литературы) 11
1.1 Классификация интерферонов 12
1.2 Интерферон-альфа 13
1.2.1 Рецептор интерферона-альфа и сигнальная трансдукция 14
.1.2.2 Молекулярный механизм действия интерферона 17
1.2.3 Биологическая активность интерферона-альфа и его место в иммунном ответе 18
1.2.4 Клиническое применение 20
1.3 Интерфероны-альфа пролонгированного действия 23
1.3.1 Пегилирование 23
1.3.1.1 Физико-химические свойства ПЭГ и пегилированных белков 23
1.3.1.2 Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицированных пептидов 25
1.3.1.3 Достоинства и недостатки ПЭГ-модифицированных пептидов 28
1.3.2 Липидизирование 29
1.3.3 Химерный белок "Альбумин-ИФН-а" 29
1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов 35
1.4.1 Экспрессия гетерологичных эукариотических генов в дрожжах 37
1.4.2 Производство гетерологичных белков в метилотрофных дрожжах Р. pastoris 38
1.5 Секреция рекомбинантных белков в дрожжах P. pastoris 46
1.5.1 Процессинг синальной последовательности 47
1.5.2 Гликозилирование 48
1.5.3 Фолдинг секреторных белков в ЭПР 52
1.5.3.1 ШапероныЭПР 54
1.5.3.2 Формирование дисульфидиых связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация . 57
1.5.3.3 Деградация неправильно сложенных белков 60
1.5.3.4 UPR - Реащия несвернутых белков 61
1.5.4 Внутриклеточные и экстраклеточные протеазы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris 66
1.5.4.1 Сериновые протеазы 66
1.5.4.2 Аспарагиновые протеазы семейства япсинов 67
1.5.4.3 Способы снижения активности протеолитических ферментов в дрожжевых системах экспрессии 69
2. Материалы и методы 73
2.1 Материалы 73
2.1.1 Штаммы 73
2.1.2 Условия культивирования штаммов 73
2.1.3 Плазмиды 76
2.2 Методы 78
2.2.1 Трансформация бактерий Е. coli 78:
2.2.2 Трансформация дрожжей по методу PLATE 78
2.2.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 79
2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 80
2.2.8 Полимеразная цепная реакция 80
2.2.9 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей 81
2.2.10 Определение концентрации белка 81
2.2.11 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS 81
2.2.13 Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris 84
2.2.14 Осаждение белков 85
2.2.15 Разделение белков в растворе. Гель-фильтрация 85
2.2.16 Разделение белков путем адсорбции. Хроматографические методы...86
2.2.17 Определение биологической активности Альбуронаїб 87
3. Результаты 89
3.1 Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка Альбуронаїб 89
3.1.1 Создание вектора экспрессии pPIC9AbFN 89
3.1.2 Получение трансформантов дрожжей P. pastoris, несущих химерный renAbFNie 93
3.1.3 Анализ продукции гетерологичного химерного белка трансформантами P. pastoris 96
3.2 Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка 99
3.3 Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции 102
3.3.1 Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка : 102
3.3.2 Влияние неорганического фосфата на продукцию химерного белка... 106
3.3.3 Влияние температуры и времени культивирования на уровень продукции химерного белка 107
3.3.4 Анализ продуктов протеолиза 109
3.3.5 Анализ влияния рН, температуры, ЭДТА, ЭГТА, PMSF и состава культуральной среды на активность экстраклеточных протеаз дрожжей Р. pastoris 113
3.4 Выделение и очистка химерного белка Альбуронаїб ...119
3.4.1 Очистка Альбуронаїб из среды ВММ 119
3.4.2 Очистка Альбуронаїб из среды ВММ2 129
4. Обсуждение 137
Выводы 161
Список литературы 162
Приложение 195
