СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................4
ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 13
1.1 Дофаминергические нейроны среднего мозга .................................................................................13
1.2 Созревание нейронов, получаемых из ЭС/ИПС клеток человека, в культуре in vitro.....15
1.3 Ускорение созревания нейронов, получаемых из плюрипотентных стволовых клеток.20
1.4 Свойства NMDA рецепторов...................................................................................................................23
1.5 Участие NMDA рецепторов в патологических процессах в нервной системе ...................24
1.6 Фармакологические характеристики NMDA рецепторов ...........................................................27
1.7 Экспрессия и функции NMDA рецепторов при нейрональной дифференцировке...........28
1.8 Экспрессия NMDA рецепторов в нейральных производных ЭС и ИПС клеток человека
.....................................................................................................................................................................................31
1.9 Структура и фармакологические свойства GABAA рецепторов...............................................32
1.10 Роль GABAA рецепторов при нейрональной дифференцировке............................................35
1.11 Роль GABAА рецепторов в патологических процессах в нервной системе.......................38
1.12 Профиль экспрессии субъединиц NMDA и GABAА рецепторов в дофаминергических
нейронах среднего мозга..................................................................................................................................39
1.13 Применение нейронов, получаемых из ИПС клеток человека для поиска и
тестирования потенциальных лекарственных средств ........................................................................42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................... 45
2.1 Реактивы ..........................................................................................................................................................45
2.2 Линии ИПС клеток ......................................................................................................................................45
2.3 Направленная дифференцировка ИПС клеток в ДА нейроны...................................................45
2.4 Получение эмбриональных нейроглиальных первичных культур из мозга мыши...........47
2.5 Получение культур астроцитов мыши ................................................................................................47
2.6 Ca2+
-имиджинг...............................................................................................................................................47
2.7 Трансдукция НП репортерными конструкциями и морфологический анализ нейронов48
2.8 ОТ-ПЦР в реальном времени ..................................................................................................................49
2.9 Получение гистологических срезов......................................................................................................50
2.10 Иммунофлуоресцентное окрашивание .............................................................................................51
2.11 Получение флуоресцентных и ацетиленовых тирамидов .........................................................54
2.15 TUNEL-анализ клеточной гибели.......................................................................................................56
3
2.16 Статистическая обработка данных…………………………………………………………………..57
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................. 58
3.1 Дифференцировка ИПС клеток человека в ДА нейроны среднего мозга in vitro..............58
3.2 Исследование транскрипции генов, кодирующих субъединицы NMDA и GABAA
рецепторов в ходе дифференцировки ИПС клеток человека в ДА нейроны..............................62
3.3 Исследование динамики экспрессии Glun2A-субъединицы NMDA рецепторов при
нейрональной дифференцировке ИПС клеток человека.....................................................................66
3.4 Исследование экспрессии Glun1 и Glun2A-субъединиц NMDA рецепторов в ДА
нейронах, получаемых из ИПС клеток человека....................................................................................70
3.5 Изучение экспрессии α2-субъединицы GABAA рецепторов при нейрональной
дифференцировке ИПС клеток......................................................................................................................72
3.5 Исследование функциональной активности NMDA и GABAA рецепторов в культурах
ДА нейронов, получаемых из ИПС клеток человека............................................................................74
3.6 Исследование роли NMDA рецепторов в развитии спонтанной активности ДА
нейронов человека ..............................................................................................................................................79
3.7 Исследование токсичности L-глутамата и мусцимола в культурах ДА нейронов
человека...................................................................................................................................................................83
3.8 Изучение роли GABAA рецепторов в регуляции роста нейритов............................................86
3.9 Разработка метода иммунофлуоресцентной детекции «Click-TSA» ......................................89
3.10 Применение ИПС клеток и их дифференцированных производных для оценки
нейропротекторной активности фармакологических соединений..................................................98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................................104
ВЫВОДЫ ....................................................................................................................................109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................110
