Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Протеогликаны 10
1.1.1. Строение и классификация гликозаминогликанов -. 10
1.1.2. Локализация и функции протеогликанов 14
1.1.3. Состав протеогликанов в трансформированных клетках 23
1.1.4. Биосинтез протеогликанов 26
1.2. D-глюкуронил С5-эпимераза 30
1.2.1. Субстратная специфичность D-глюкуронил С5-эпимеразы 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы 42
2.2. Методы 45
2.2.1. Выделение РНК 45
2.2.2. Обратная транскрипция 45
2.2.3. Анализ экспрессии генов методом мультиплексной ОТ-ПЦР 46
2.2.4. Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 46
2.2.5. Количественная ПЦР в реальном времени 47
2.2.6. Вестерн-блот анализ 47
2.2.7. Иммуногистохимия 48
2.2.8. Клонирование 49
2.2.9. Трансфекция и отбор клонов, стабильно экспрессирующих эпимеразу 49
2.2.10. Определение клеточной пролиферации in vitro 50
2.2.11. Определение влияния D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo 50
2.2.12. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Результаты 52
3.1 . Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы 52
3.1.1. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека 52
3.1.2. Подбор условий ПЦР с различными праймерами для изучения экпрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы 53
3.1.3. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом мультиплексной ОТ-ПЦР 55
3.1.4. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом количественной ПЦР в реальном времени 57
3.1.5. Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени 59
3.1.6. Определение присутствия белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в тканях молочной железы человека методом Вестерн-блота 60
3.1.7. Анализ экспрессии гена D-глюкурнил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека 62
3.2. Ген-инактивирующий тест (GIT - Gene Inactivaion Test) 63
3.2.1. Клонирование гена D-глюкуронил С5-эпимеразы 65
3.2.2. Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов 67
3.2.3. Изучение влияния экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo 69
3.2.4. Анализ экспериментальных опухолей 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
Выводы: 78
Список литературы: 79
От автора 95
