Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика эпидемии ВИЧ/СПИД в мире 10
1.2. Структура генома ВИЧ-1 и вирусные белки 12
1.3. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 21
1.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ-1 21
1.3.2. Рекомбинационная изменчивость генома ВИЧ-1 27
1.4. Филогенетическая классификация штаммов ВИЧ-1 29
1.4.1. История развития филогенетической классификации ВИЧ-1 29
1.4.2. Современная филогенетическая классификация ВИЧ -1 32
1.5. Методы определения генетического разнообразия и субтипов ВИЧ-1 39
1.5.1. Секвенирование амплифицированных фрагментов генома ВИЧ-1, полученных методом полимеразной цепной реакции 39
1.5.2. Секвенирование полноразмерных геномов ВИЧ-1 44
1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 46
1.6.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в мире 46
1.6.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в странах бывшего СССР 49
1.7. Фенотипические свойства штаммов ВИЧ-1 52
2. Материалы и методы 56
2.1. Образцы крови 56
2.2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови 57
2.3. Методы очистки ДНК 57
2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови 57
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 58
2.3.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 58
2.4. Стратегия аплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК ВИЧ- инфицированных пациентов 59
2.5. Реакции ферментативной модификации ДНК 63
2.5.1. Полимеразная цепная реакция 63
2.5.2. Реакция лигирования фрагментов ДНК 65
2.5.3. Реакция рестрикции плазмидной ДНК 66
2.5.4. Реакция ферментативного секвенирования ДНК 66
2.6. Методы электрофореза ДНК 69
2.6.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 69
2.6.2. Препаративный электрофорез ДНК в легкоплавкой агарозе 69
2.6.3. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле 69
2.7. Микробиологические методы 70
2.7.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli для трансформации 70
2.7.2. Трансформация клеток Е. coli 71
2.8. Компьютерные методы анализа данных 71
2.8.1. Первичный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей... 71
2.8.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 72
2.8.3. Анализ функциональных элементов в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях ВИЧ-1 77
2.8.4. Статистический анализ полученных результатов 79
3. Результаты 80
3.1. Изучение генетического разнообразия ВИЧ-1 80
3.1.1. Результаты амплифицирования участков генов env и gag ВИЧ-1 80
3.1.2. Результаты секвенирования участков генов env и gag ВИЧ-1 83
3.1.3. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участков генов env и gag ВИЧ-1 88
3.1.4. Результаты анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых участками генов env и gag ВИЧ-1 92
3.1.5. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последова тельностей участков генов env и gag ВИЧ-1 97
3.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома штаммов ВИЧ-1 102
3.2.1. Результаты амплифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1 102
3.2.2. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей молекулярных клонов фрагментов генома ВИЧ-1 106
3.2.3. Реконструкция полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома штаммов ВИЧ-1 109
3.3. Анализ полноразмерного генома ВИЧ-1 111
3.3.1. Результаты анализа функциональных элементов генома ВИЧ-1 111
3.3.2. Результаты филогенетического анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1 119
4. Обсуждение результатов 127
4.1. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 в странах бывшего СССР 127
4.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома вариантов
ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР 135
4.3. Филогенетический анализ доминирующих в странах бывшего СССР вариантов ВИЧ-1 140
4.4. Характерные особенности вариантов ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР 148
Выводы 155
Список литературы 156
