Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Болезнь Альцгеймера 15
1.1.1. Определение БА 15
1.1.2. Этиология и патогенез БА 15
1.1.2.1 Амилоидная гипотеза 16
1.1.2.2. Холинергическая гипотеза .17
1.1.3. Фармакотерапия БА 18
1.1.3.1. Стратегии лечения БА 18
1.1.3.2. Нейропротективное действие никотина .21
1.1.3.3. Alpha7nAChR как мишень фармакотерапии БА..22
1.2. Никотиновый ацетилхолиновыи рецептор типа альфа7 26
1.2.1. Семейство никотиновых ацетилхолиновых рецепторов26
1.2.2. Характеристика alpha7nAChR 27
1.2.2.1. Ген и варианты альтернативного сплайсинга alpha7nAChR 28
1.2.2.2. Локализация и функция alpha7nAChR в головном мозге 29
1.2.2.3. Локализация и функция alpha7nAChR в периферических органах 31
1.2.3. Биогенез никотиновых ацетилхолиновых рецепторов 34
1.2.3.1. Клеточный аппарат, регулирующий биогенез nAChR 35
1.2.3.2. Влияние типа клеток на экспрессию функционально активного alpha7nAChR 37
1.3. RIC-3-LijanepoHalpha7nACriR 42
1.3.1. Структура RIC-3 42
1.3.2. Локализация RIC-3 43
1.3.3. Функция RIC-3 44
1.4. BDNF как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера 47
2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Выделение РНК 50
2.2. Синтез кДНК 50
2.3. Стандартные методы молекулярной биологии 50
2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.5. Конструирование плазмидных векторов 53
2.6. Количественная риал-тайм ПЦР 56
2.7. Культивирование клеток 57
2.8. Первичная культура нейронов 57
2.9. Транзиентные трансфекции 58
2.10. Создание рекомбинантных клеточных линий 58
2.11. Окрашивание флюоресцентным a-Bgt 59
2.12. Иммуноцитохимия 59
2.13. FLIPR анализ 60
2.13.1. Реагенты для FLIPR теста 62
2.13.2. Анализ данных FLIPR теста 62
2.13.3. Оценка качества FLIPR теста 63
3. Результаты 64
3.1. Клонирование и характеристика RIC-3 65
3.1.1 Клонирование RIC-3 человека 65
3.1.2. Идентификация нового варианта RIC-3 человека 66
3.1.3. Экспрессия вариантов RIC-3 в тканях человека 69
3.1.4. Предсказание in silico и клонирование RIC-3 крысы 70
3.1.4.1. Идентификация in silico и характеристика RIC-3 крысы 70
3.1.4.2. Клонирование RIC-3 крысы 72
3.1.5. Идентификация и анализ структуры вариантов альтернативного сплайсинга RIC-3 76
3.1.6. Анализ экспрессии вариантов RIC-3 S+/S- в тканях и органах 78
3.1.7. Количественный анализ экспрессии RIC-3 и alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы 80
3.1.8. Субклеточная локализация и транспорт RIC-3 крысы 91
3.1.9. Влияние RIC-3 на поверхностную экспрессию alpha7nAChR 94
3.2. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функциональный alpha7nAChR человека 96
3.2.1. Создание клеточной линии, экспрессирующей alpha7nAChR человека и RIC-3 человека 96
3.2.2. Фармакологическая характеристика клеток СНО-К1, экспрессирующих рекомбинантный человеческий alpha7nAChR 98
3.3. Изучение влияния препарата семакс на уровень BDNF в мозге крысы 107
4. Обсуждение 110
4.1. Клонирование и характеристика RIC-3 112
4.2. Экспрессия транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в разных органах 114
4.3. Субклеточная локализация и функция RIC-3 116
4.4. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR 118
4.5. Влияние семакса на уровень BDNF в мозге крысы 122
Выводы 125
