Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1. р53-зависимая системазащиты генома и ее нарушение при развитии отдаленных последствий действия радиации .12
1.1.1. Контроль функциональной активности белка р53 на различных уровнях .12
1.1.2. Механизмы снижения эффективности функционирования белка р53 .15
1.1.3. Функциональная активность системы Р53-MDM2-MDM4 после облучения ...17
1.2. Роль микроРНК в функционировании р53-системы защиты генома в отдаленный период после облучения 20
1.2.1. МикроРНК, их биогенез и функции, а также причины нарушения экспрессии микроРНК, значение в диагностике и терапии заболеваний .20
1.2.2. МикроРНК и р53 .27
1.2.3.МикроРНК, модулирующие активнсть р53 после воздействия ионизирующей радиации 42
1.3. Эксперименты по изучению экспрессии микроРНК, модулирующих активность р53-системы защиты генома, в отдаленные сроки после облучения 50
ГЛАВА 2 Материалы и методы .59
2.1. Объект исследования .59
2.1.1. Животные 59
2.1.2. Пациенты, пренесшие ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .60
2.1.3. Онкологические больные, перенесшие курс ЛТ .61
2.2. Методы исследования .61
2.2.1. Получение гомогената клеток костного мозга крыс .61
2.2.2. Получение гомогената ткани молочной железы крыс .61
2.2.3. Выделение общей РНК, содержащей фракцию зрелых микроРНК из гомогената костного мозга и молочной железы, а также цельной крови .63
2.2.4. Определение концентрации РНК 63
2.2.5. Обратная транскрипция для мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 крыс и
человека 63
2.2.6. Обратная транскрипция для зрелых miR-21, miR-34, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7 крыс и человека со шпилькообразными праймерами «stem-loop» .64
2.2.7. Основные этапы подбора праймеров для целевых генов Р53, MDM2, MDM4, mir-34, mir-125b, mir-145, mir-16, mir-21, let-7 и конститутивных генов GAPDH, -actin крыс и человека для постановки ПЦР в реальном времени .66
2.2.8. ПЦР в реальном времени .69
2.2.9. Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в реальном времени 74
2.2.10. Статистическая обработка результатов .75
ГЛАВА 3 Результаты исследования .76
3.1. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую систему защиты генома, в опухолях молочных желез и костном мозге аутбредных крыс-самок после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 76
3.1.1. Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыс-самок в условиях проведенного эксперимента 76
3.1.2. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате опухолей молочных желез аутбредных крыс-самок на 315 и 550 сутки после -облучения в дозе 2,5 Гр .77
3.1.3. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессия зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс самок на 75, 315 и 550 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 80
3.1.4. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4, miR-34с, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 в гомогенате опухолей молочных желез и костного мозга аутбредных крыс-самок на 75, 315 и 550 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 88
3.2. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53-зависимую системузащиты генома, в отдаленный период у лиц, перенесших ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .91
3.2.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови лиц в отдаленный период после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП с помощью метода ПЦР в реальном времени со специально подобранными праймерами и условиями амплификации 91
3.2.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови пациентов в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП 93
3.3. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую системусохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после курса дистанционной -терапии 95
3.3.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ, РГШ до и после полного курса ЛТ с помощью метода ПЦР в реальном времени с теми же праймерами и условиями амплификации, которые были экспериментально подобраны при исследовании крови пациентов с диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .95
3.3.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4, miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ до и после полного курса дистанционной -терапии 99
ГЛАВА 4 обсуждение результатов исследования 101
Заключение 125
Выводы 127
Список литературы
