Введение
Обзор литературы 7
I. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) 7
1. История открытия и номенклатура семейства Y-бокс-связывающих белков 7
2. Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков 9
2.1. Общие свойства Y-бокс-связывающих белков 9
2.2. Свойства Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1) 11
2.2.1. Взаимодействие YB-1 с белками 12
2.2.2. Особенности взаимодействия YB-1 с ДНК и РНК 12
3. Функции YB-1 в ядре 14
3.1. Участие YB-1 в транскрипции 14
3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК 16
3.3. Участие YB-1 в сплайсинге мРНК 16
4. Функции YB-1 в цитоплазме 17
5. Перераспределение YB-1 между ядром и цитоплазмой 21
6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии 23
7. YB-1 и раковая трансформация клеток 24
8. Структура гена YB-1 и регуляция его экспрессии 26
II. Роль 3 НТО мРНК в регуляции трансляции 27
1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3 НТО 29
2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3 НТО 39
Материалы и методы 44
1. Использованные в работе плазмиды. Получение конструкций, содержащих ген YB-1 с мутациями в регуляторной последовательности 44
2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК 46
3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli 46
4. Обработка плазмиды рестриктазой 47
5. Лигирование Т4-ДНК-лигазой 48
6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 48
8. Выделение рекомбинантного РАВР 51
9. Выделение рекомбинантного YB-1 52
10. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика 53
11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 53
12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы 54
13. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины 54
14. Метод замедления подвижности РНК-белковых комплексов в геле (Gel-shift assay) 55
15. РНК-белковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения 55
16. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы 56
17. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика 56
18. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда) 56
19. Детекция мРНК YB-1 при помощи радиоактивного зонда (Northern-dot анализ) .56
20. Дефосфрилирование фрагмента РНК 57
21. Мечение фрагмента РНК по 5 концу 58
22. Картирование сайтов связывания белков с фрагментом РНК 58
23.БиотинилированиеРНК 59
24. Выделение белков лизата ретикулоцитов кролика с использованием биотинилированной РНК 60
25. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг) 60
РЕЗУЛЬТАТЫ 62
1. YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 43S преинициаторного комплекса 62
2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43S преинициаторного комплекса 64
3. Локализация сайтов связывания YB-1 и РАВР в регуляторной . последовательности мРНК YB-1 методом футпринтинга 66
4. Подтверждение специфичности взаимодействия YB-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, идентифицированными методом футпринтинга 68
5. РАВР и YB-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК YB-1 71
6. Влияние мутаций в YB-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК YB-1 на её трансляцию 73
7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1 74
8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB-1 75
Обсуждение 78
1. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и её место в общей регуляции белкового синтеза 78
2. Возможные механизмы влияния YB-1 и РАВР на трансляцию мРНК YB-1 79
3. Специфическое взаимодействие YB-1 с РНК 81
4. Негативный эффект полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляцию как новый способ регуляции синтеза YB-1 82
Выводы 84
Список литературы 85
