Введение
Введение 5
Актуальность темы исследования 5
Цель работы 5
Задачи исследования 6
Новизна полученных результатов 7
Апробация результатов исследования 7
Обзор литературы 8
Серин-треониновая протеинкиназа LOSK/SLK 8
Цитоскелет и его функции в животных клетках 13
3.2.1. Микротрубочки 13
3.2.1.1. Белки, ассоциированные с микротрубочками (МАР) 15
3.2.1.2. Моторные белки микротрубочек 16
3.2.1.3. Динеин-динактиновый комплекс 16
3.2.2. Центр организации микротрубочек 4.
3.2.2.1. Структура центросомы 19
3.2.2.2. Роль центросомы в организации микротрубочек 21
3.2.2.3. Регуляция организации центросомных микротрубочек протеинкиназами 24
3.2.3. Альтернативные способы организации микротрубочек 25
3.2.3.1. Организация микротрубочек в отсутствие центросомы в клетке 25
3.2.3.2. Участие аппарата Гольджи в организации микротрубочек 3.2.4. Промежуточные филаменты 30
3.2.5. Актиновые филаменты 30
Малые ГТФазы 32
3.3.1. Малая ГТФаза RhoA 34
3.3.2. Клеточная подвижность и поляризация клеток 37
Материалы и методы 41
Материалы 41
4.1.1. Оборудование 41
4.1.2. Расходные материалы 41
4.1.3. Биологический материал
4.1.3.1. Иммортализованные эукариотические линии клеток 42
4.1.3.2. Бактериальные штаммы:
4.1.4. Основные реагенты 42
4.1.5. Ферменты и ДНК-вектора 43
4.1.6. Готовые наборы для молекулярно-биологических работ 43
4.1.7. Среды для культивирования и основные буферные растворы 44
4.1.8. Синтетические олигонуклеотиды 45
4.1.9. Генетические конструкции 46
4.1.10. Антитела з
4.2. Методы 4.2.1.
Работа с эукариотическими клетками
4.2.1.1. Культивирование клеточных линий 49
4.2.1.2. Липосомная трансфекция клеток плазмидной ДНК 49
4.2.1.3. Химические воздействия на клетки 49
4.2.1.4. Фиксация клеток и иммуноцитохимическое окрашивание 50
4.2.1.5. Анализ миграции клеток в рану монослоя 50
4.2.1.6. Получение цитопластов 51
4.2.1.7. Иммунофлуоресцентная микроскопия и прижизненные наблюдения клеток 51
4.2.1.8. Обработка результатов 52
4.2.2. Работа со штаммами E. coli 54
4.2.2.1. Получение компетентных клеток E. Coli 54
4.2.2.2. Трансформация бактерий 54
4.2.2.3. Синтез рекомбинантных белков в E. Coli 55
4.2.3. Методы молекулярного клонирования 55
4.2.3.1. Выделение тотальной РНК из клеток 55
4.2.3.2. Определение концентрации нуклеиновых кислот 56
4.2.3.3. Синтез кодирующей ДНК с мРНК 56
4.2.3.4. Полимеразная цепная реакция 56
4.2.3.5. Сайт-направленный мутагенез 57
4.2.3.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 57
4.2.3.7. Выделение ДНК из геля 58
4.2.3.8. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 58
4.2.3.9. Лигирование фрагментов ДНК 58
4.2.3.10. Выделение плазмидной ДНК 4.2.4.
Работа с белками
Выделение и очистка рекомбинантных белков. 59
Киназная реакция in vitro 60
Иммунопреципитация 60
Приготовление клеточных гомогенатов для белкового Белковый электрофорез в денатурирующих условиях 61
Окрашивание полиакриламидных гелей 61
Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 61
Окрашивание антителами и проявление 5.
Результаты
5.1. Генетические конструкции, полученные в работе 63
5.2. Фосфорилирование p150Glued киназой LOSK 5.2.1. Каждый из треонинов 145-147 изоформы 1А белка p150Glued может быть фосфорилирован киназой LOSK in vitro 64
5.2.2. Мутации p150Glued в сайте узнавания LOSK, обнаруженные у больных амиотрофическим склерозом, усиливают его фосфорилирование 65
5.3. Участие протенкиназы LOSK в регуляции внутриклеточного
транспорта и функций динактина 67
5.3.1. Полноразмерные GFP-слитые молекулы нефосфорилируемого и
имитирующего фосфорилирование p150Glued включаются в динактиновый комплекс 67 5.3.2. Фосфорилирование р150Glued киназой LOSK не влияет на активность динеинового транспорта в клетке 68
5.3.3. Ингибирование LOSK нарушает внутриклеточный транспорт на длинные дистанции 71
5.3.4. Фосфорилирование белка p150Glued протеинкиназой LOSK определяет его центросомную локализацию 73
5.4. Регуляция центросомной локализации PCM-1 посредством LOSK 75
5.4.1. Ингибирование LOSK вызывает перераспределение центросомного белка PCM-1 в цитоплазму 75
5.4.2. Нарушение естественной локализации p150Glued в клетках ведёт к истощению центросомного пула PCM-1 76
5.4.3. Нарушение радиальной системы микротрубочек приводит к снижению содержания PCM-1 на центросоме до уровня, наблюдаемого при ингибировании LOSK 80
5.4.4. Ингибирование LOSK, сопровождаемое потерей центросомной локализации белком PCM-1, не приводит к значительным нарушениям формирования первичных ресничек в клетках 82
5.5. Участие LOSK в организации микротрубочек на аппарате Гольджи 84
5.5.1. Выбор клеточной модели для изучения организации микротрубочек посредством аппарата Гольджи 84
5.5.2. В клетках, использующих аппарат Гольджи в качестве ЦОМТа, активность LOSK незначительно влияет на организацию микротрубочек 86
5.6. Регуляция клеточной подвижности протеинкиназой LOSK 88
5.6.1. Выбор экспериментальной модели для изучения миграции клеток. Ингибирование LOSK приводит к нарушениям клеточной миграции 88
5.6.2. Точечная мутация RhoA в сайте фосфорилирования киназой LOSK приводит к изменению подвижности клеток 90
5.6.3. Генетические конструкции, кодирующие GFP-слитые RhoA, обладающие различной активностью, по-разному влияют на клеточную подвижность 91
5.6.4. Имитирующая фосфорилирование RhoA восстанавливает скорость, но не направленность движения клеток на фоне ингибирования LOSK 93
5.6.5. Имитирующий фосфорилирование p150Glued способен частично восстанавливать направленность движения клеток 95
5.6.6. Ингибирование LOSK или экспрессия RhoA-S188A изменяют морфологию актинового цитоскелета 97
5.6.7. Ингибитор RhoA-зависимой киназы p160ROCK восстанавливает параметры клеточной подвижности на фоне ингибирования LOSK 99
5.6.8. Поляризация аппарата Гольджи в клетках зависит от активности RhoA. RhoA-S188Е восстанавливает поляризацию АГ при ингибировании LOSK. 101
5.6.9. Способность клеток к направленной миграции не зависит от состояния системы микротрубочек, регулируемого LOSK
6. Обсуждение результатов 104
7. Заключение 114
8. Выводы 115
9. Список сокращений 116
