Введение
Глава 1. Возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis, методы диагностики и противотуберкулезная химиотерапия 15
1.1. Туберкулезная инфекция 15
1.1.1 Различные филогенетические линии M. tuberculosis 18
1.2. Методы диагностики туберкулеза 21
1.2.1. Метод микрокопирования окрашенного образца и культуральные методы 22
1.2.2. Молекулярные методы диагностики 22
1.2.3. Методы Масс-спектрометрии и ИФА- тест 23
1.2.4. Анализ липоарабиноманнана 24
1.3. Противотуберкулезная химиотерапия 24
Глава 2. Лекарственная устойчивость M. tuberculosis, природная и приобретенная 28
2.1. Лекарственная устойчивость 28
2.2. Приобретенная лекарственная устойчивость
2.2.1. Устойчивость к рифампицину 30
2.2.2. Устойчивость к изониазиду 30
2.2.3. Устойчивость к фторхинолонам 31
2.2.4. Устойчивость к стрептомицину 32
2.2.5. Устойчивость к канамицину 32
2.2.6. Устойчивость к пиразинамиду 33
2.2.7. Устойчивость к сиртуро/бедаквилин/TMC207 34
2.3. Природная лекарственная устойчивость 38
2.3.1. Белки модификаторы мишеней 38
2.3.2 Белки деградации лекарств 40
2.3.3. Белки модификаторы лекарств 41
2.3.4. Белки молекулярной мимикрии 42
2.3.5. Системы токсин-антитоксин 43
2.3.6. Белки клеточного транспорта 45
2.3.7. Организация клеточной стенки, е проницаемость 46
2.3.8. Белки клеточного стресса 48
2.3.9. Семейство транскрипционных факторов WhiB 52
2.3.10. Транскрипционный фактор WhiB7 57
2.4. Вещества, снижающие лекарственную устойчивость (адъюванты антибиотиков) 64
Глава 3. Материалы и методы 66
3.1. Бактериальные штаммы, использованные в работе 66
3.2. Плазмидные векторы, использованные в работе 66
3.3. Олигонуклеотиды, использованные в работе
3.3.1. ДНК, использованная в работе 67
3.3.2. Выделение РНК 68
3.3.3. Проведение реакции обратной транскрипции 68
3.4. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 69
3.4.1. Амплификация ДНК 69
3.4.2. Амплификация ДНК в режиме реального времени 69
3.4.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 70
3.4.4. Очистка фрагментов ДНК 71
3.4.5. Выделение ДНК из агарозного геля 71
3.4.6. Реакция рестрикции 71
3.4.7. Реакция лигирования 72
3.4.8. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле 72
3.4.9. Количественная оценка ДНК, РНК 3.4.10. Сайт-направленный мутагенез гена whiB7 73
3.4.11. Пиросеквенирование ДНК M. tuberculosis 73
3.4.12. Генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis 74
3.5. Работа с бактериальными культурами 74
3.5.1. Подбор концентраций антибиотиков 75
3.5.2. Оценка уровня лекарственной чувствительности 75
3.5.3. Получение химически-компетентных клеток E. coli 76
3.5.4. Трансформация компетентных клеток E. coli 77
3.5.5. Получение электрокомпетентных клеток M. smegmatis 77
3.5.6. Электротрансформация компетентных клеток M. smegmatis 77
3.5.7. ПЦР-скрининг клеток трансформантов 78
3.6. Биоинформатические методы и методы статистического анализа данных78
Глава 4. Результаты и обсуждение 80
4.1. Биоинформатический анализ генов регулона WhiB7 и других основных групп генов природной лекарственной устойчивости 80
4.1.1. Формирование каталога генов природной лекарственной устойчивости M. tuberculosis 82
4.1.2. Оценка связи между мутациями в генах природной лекарственной устойчивости и линией или фенотипом лекарственной устойчивости M. tuberculosis. 86
4.1.3. Поиск мутаций генов регулона WhiB7 у клинических изолятов M. tuberculosis 90
4.1.4. Сравнительный геномный анализ клинических изолятов M. tuberculosis 94
4.1.5. Биоинформатическая оценка влияния отобранных аллельных вариантов генов регулона WhiB7 на функциональную активность кодируемых ими белков 98
4.1.6. Заключение к разделу 4.1. 101
4.2. Оценка влияния генов регулона WhiB7 на уровень лекарственной устойчивости 102
4.2.1 Клонирование генов регулона WhiB7 в M. smegmatis 102
4.2.2. Влияние сверхэкспрессии гена whiB7 на уровень лекарственной устойчивости M. smegmatis 104
4.2.3. Влияние сверхэкспрессии гена tap на уровень лекарственной устойчивости M. smegmatis 105
4.2.4. Влияние сверхэкспрессии гена Rv1473 на уровень лекарственной устойчивости M. smegmatis 106
4.2.5. Определение МИК антибиотиков для трансформантов M. smegmatis 108
4.2.6. Заключение к разделу 4.2. 110
4.3. Исследование явления перекрестной лекарственной устойчивости M. smegmatis mc2 155 111
4.3.1. Принципы и методика изучения индукции перекрестной лекарственной устойчивости к антибиотикам у M. smegmatis 111
4.3.2. Отбор генов-кандидатов, потенциально определяющих выявленный тип перекрестной устойчивости 119
4.3.3. Исследование экспрессии генов природной перекрестной лекарственной устойчивости и толерантности M. smegmatis 123
4.3.4. Заключение к разделу 4.3. 131
Заключение 133
Выводы 136
Список сокращений, использованных в работе 137
Словарь терминов 139
Список Литературы 140
