Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1 Получение трансгенных растений: общие сведения 14
1.2 Наследование чужеродных генов и вариабельность их экспрессии у трансгенных растений 20
1.3 Инактивация чужеродных генов в растительном геноме 24
1.4 Молекулярно-генетические механизмы инактивации чужеродной ДНК в ядерном геноме трансгенных растений 32
1.4.1 Структура и местоположение экзогенной ДНК в растительном геноме 32
1.4.2 Замолкание экспрессии трансгена и модификация ДНК 34
1.4.3 Мутации растительных генов, влияющих на процесс инактивации экспрессии чужеродной ДНК 40
1.5 Примеры инактивации экспрессии множественных копий собственных * растительных генов 50
1.6 Инактивация экспрессии множественных копий генов у грибов-аскомицетов 52
1.7 Использование феномена инактивации экспрессии множественных копий генов для целенаправленного выключения экспрессии растительных генов 54
1.8 Стратегия предотвращения инактивации целевых генов в трансформированных растениях 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
2.1 Получение трансгенных растений табака 62
2.2 Типы генетических конструкций 63
2.3 Гибридологический анализ трансгенных растений табака 65
2.4 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II in situ 67
2.5 Флуориметрическое определение активности |3-глюкуронидазы в листьях трансгенных растений табака 68
2.6 Выделение геномной ДНК из листьев табака 69
2.7 Саузерн блот гибридизация геномной ДНК трансгенных растений табака 70
2.8 Выделение РНК из растительной ткани и точечный Нозерн блоттинг 70
2.9 Подтверждение наличия дупликаций в области инсерции Т-ДНК с помощью метода ПЦР 71
2.10 Проверка исходных трансформантов на присутствие в растительном геноме векторных последовательностей с помощью метода ПЦР 72
2.11 Электрофоретический анализ ДНК 73
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 74
3.1 Стабильность экспрессии маркерного гена прШ у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК 74
3.2 Анализ стабильности наследования гена прШ у трансгенных растений табака со множественными инсерциями Т-ДНК 81
3.3 Моделирование влияния дупликации в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии маркерных генов nptll и uidA в трансгенных растениях табака 87
3.3.1 Сравнительный анализ стабильности экспрессии гена nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и с дупликациями данного гена в составе Т-области) 87
3.3.2 Анализ активности ферментов (З-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена) 92
3.3.3 Анализ стабильности экспрессии гена nptll у гибридов Fi от различных типов скрещиваний 98
3.3.4 Встраивание векторных последовательностей в растительный геном исходных трансгенных растений табака 110
3.4 Мозаичный характер проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21 113
Заключение 144
Выводы 148
Список цитируемой литературы
