Введение
ГЛАВА 1. Структура и спектральные свойства цветных флуоресцирующих белков 8
1.1. Стабильность GFP -подобных белков 12
1.1.1. Влияние температуры 12
1.1.2. Влияние рН 12
1.1.3. Действие протеаз 13
1.2. Третичная структура GFP и его гомологов 13
1.3. Спектральное разнообразие GFP-подобных белков 15
1.4. Основные типы хромофоров GFP-нодобных белков 18
1.4.1. Зеленый хромофор GFP-типа 18
1.4.2. Структура красного хромофора DsRed типа 18
1.4.3. Структура хромофора asFP595 19
1.4.4. Структура хромофора Kaede 20
1.4.5. Структура хромофора zFP538 20
1.5. Формирование хромофора GFP, DsRed и zFP538 21
1.5.1. Формирование структуры «зеленого» хромофора 21
1.5.2. Формирование ацилимина в хромофоре DsRed-типа 24
1.5.3. Формирование желтого хромофора zFP538 27
ГЛАВА 2. Олигомеризация и агрегация цветных флуоресцирующих белков 30
2.1. Олигомеризация цветных флуоресцирующих белков 30
2.1.1. GFP из кишечнополостных Hydrozoa 30
2.1.2. Цветные белки из кораллов 30
2.1.3. Структура тетрамеров DsRed и zFP538 31
2.2. Агрегация цветных белков из кораллов 36
2.3. Биологическая функция GFP-нодобных белков 38
ГЛАВА 3. Влияние рн на флуоресценцию и поглощение цветных белков 41
3.1. Взаимодействие между хромофором и белковым окружением 41
3.2. Влияние рН на спектральные свойства GFP 43
3.3. Влияние рН на спектральные свойства хромопептидов GFP 46
3.4. Протонированные состояния хромофора GFP 49
3.4.1. Теоретические расчеты 49
3.4.2. Экспериментальные данные 54
ГЛАВА 4. Фотофизика и фотохимия gfp-подобных белков 57
4.1. Перенос протона в возбужденном состоянии 57
4.2. Поворот хромофора в возбужденном состоянии. Цис-транс изомеризация 58
4.2.1. Изучение модельных хромофоров 59
4.2.2. Модель фотоизомеризации 65
4.2.3. Изучение белков 66
4.3. Конформационная подвижность -бочонка GFP 70
ГЛАВА 5. Аппаратура, реагенты, методики экспериментов 72
5.1. Используемые реагенты и оборудование 72
5.2. Экспрессия и выделение zFP538 72
5.3. Выделение хромопентидов из zFP538 73
5.4. Спектроскопия и рН-метрия 75
5.4.1. Титрование хромопептидов 75
5.4.2. Титрование белка zFP538 75
5.5. Динамическое рассеяние света 77
5.6. Гель-фильтрация 77
5.7. Подготовка образца для сканирующей зондовой микроскопии 78
5.7.1. На поверхности стекла 78
5.7.2. Сорбция на поверхности графита 79
5.8. Кинетические измерения 79
5.9. Расчет значений рКа из рН-профилей 79
5.9.1. Одностадийная схема 1 80
5.9.2. Двустадийная схема 2 81
5.9.3. Трехстадийная схема 3 81
ГЛАВА 6. Анализ рн-зависимостей хромопептидов 83
6.1. Имино-форма хромопептнда zFP538. Поглощение 83
6.2. Имино-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция 92
6.3. Кето-форма хромопептнда zFP538. Поглощение 94
6.4. Кето-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция 96
ГЛАВА 7. Анализ рн-зависимостей желтого белка zFP538 98
7.1. рН-зависимости поглощения желтого белка zFP538 98
7.1.1. Поглощение концентрированного раствора 98
7.1.2. рН-зависимость поглощения разбавленного раствора zFP538 103
7.2. рН-зависимости флуоресценции zFP538 107
7.2.1. Флуоресценция растворов с высокой концентрацией белка 107
7.2.2. Флуоресценция разбавленных растворов zFP538 109
7.2.3. Эффект начального значения рН 112
7.2.4. Анализ полных рН-профилей флуоресценции разбавленных растворов zFP538. 115
7.2.5. Нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции zFP538 от концентрации белка 117
ГЛАВА 8. Оценка размеров агрегатов zFP538 120
8.1. Светорассеяние 120
8.2. Гель-фильтрация 120
8.3. Исследование агрегации zFP538 с помощью микроскопии 123
8.3.1. На поверхности стекла 123
8.3.2. На поверхности графита 129
ГЛАВА 9. Кинетика кислотной денатурации zFP538 135
9.1. Кинетические кривые 135
9.2. Спектральные изменения, наблюдаемые при кислотной денатурации zFP538 140
9.3. Предполагаемая схема кислотной инактивации zFP538 143
ГЛАВА 10. Механизмы стабилизации структуры zfp538 за счет агрегации 144
Выводы 151
Список литературы 153
Приложения 168
