Введение
Раздел 1 Биология инсектицидов (обзор литературы) 15
1.1 Краткая история применения инсектицидов 15
1.2 Описание и механизм действия некоторых инсектицидов 21
1.3 Необходимость применения инсектицидов и причины создания новых препаратов 33
1.4 Вредные последствия использования химических инсектицидов для окружающей среды 39
1.5 Преимущества современных агентов регуляции численности насекомых как предпосылки к созданию ДНК-инсектицидов 41
1.6 Особенности разработки ДНК-инсектицидов с высоким уровнем экологичности 47
1.7 Трудности, связанные с разработкой РНК-препаратов для контроля численности чешуекрылых насекомых, и преимущества ДНК-инсектицидов 56
1.8 Первый эксперимент по применению ДНК-инсектицидов на непарном шелкопряде 60
1.9 Происхождение применённых против непарного шелкопряда ДНК инсектицидов и их связь с апоптозом 62
1.10 Непарный шелкопряд как листогрызущее насекомое 68
Раздел 2 Объекты и методы проведения исследований 71
2.1 Происхождение гусениц непарного шелкопряда и других насекомых 71
2.2 Выращивание насекомых в лабораторных условиях 72
2.3 Взвешивание насекомых 74
2.4 Дизайн олигонуклеотидов 74
2.5 Обработка насекомых ДНК-олигонуклеотидами 74
2.6 Заражение гусениц ВЯП НШ 75
2.7 Исключение и доказательство заражения непарного шелкопряда ВЯП 76
2.8 Выращивание растений 76
2.9 Взвешивание растений 77
2.10 Анализ содержания глюкозы и активности щелочной фосфатазы в 77
растениях 77
2.11 Выделение, амплификация ДНК и детекция продуктов амплификации 78
2.12 Выделение РНК 81
2.13 Обратная транскрипция 83
2.14 Секвенирование ДНК 83
2.15 ПЦР в реальном времени (анализ экспрессии генов) 84
2.16 Гистологические исследования 85
2.17 Детекция апоптотической "лестницы ДНК" 85
2.18 Измерение кальция и магния в тканях яиц насекомого 86
2.19 Определение количества погибших клеток в исследуемой популяции стволовых клеток быка домашнего 86
2.20 Анализ масла мяты перечной методом газовой хроматографии 88
2.21 Обнаружение олигонуклеотида oligoRIBO-11 методом матрично активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) 88
2.22 Обнаружение проникновения oligoRIBO-11-фрагмента и oligoRING фрагмента методом спектрофотометрии 90
2.23 Статистический анализ 90
Раздел 3 Влияние коротких одноцепочечных фрагментов антиапоптозных генов на биологические показатели безвирусного шелкопряда и других насекомых 91
3.1 Повышение смертности насекомого 91
3.2 Снижение биомассы насекомого 102
3.3 Уменьшение количества самок в обработанном oligoRING-фрагментом поколении 107
3.4 Переход инсектицидного эффекта oligoRING-фрагмента в следующее поколение – повышение содержания кальция и магния в тканях яиц шелкопряда и снижение скорости развития эмбрионов 112
Раздел 4 Изучение эффекта повышения смертности гусениц непарного шелкопряда, заражённых вирусом ядерного полиэдроза и обработанных коротким антисмысловым фрагментом его антиапоптозного IAP-3-гена 120
4.1 Повышение смертности гусениц, которых заразили ВЯП НШ в лабораторных условиях 120
4.2 Снижение биомассы гусениц, которых заразили ВЯП НШ в лабораторных условиях 133
4.3 Повышение смертности гусениц, которые были заражены ВЯП НШ в природе 135
Раздел 5 Обнаружение клеточного ответа на действие oligoring-фрагмента антиапоптозного IAP-3-гена ВЯП НШ у безвирусных и заражённых этим вирусом гусениц непарного шелкопряда 138
5.1 Безвирусные гусеницы непарного шелкопряда 138
5.1.1 Доказательство проникновения oligoRING-фрагмента в клетки непарного шелкопряда 138
5.1.2 Снижение экспрессии антиапоптозного IAP-1-гена непарного шелкопряда под действием oligoRING-фрагмента антиапоптозного IAP-3-гена ВЯП НШ 141
5.1.3 Обнаружение антиапоптозного IAP-Z-гена шелкопряда, обладающего высокой степенью гомологии с антиапоптозным IAP-3-геном ВЯП НШ, и снижение его экспрессии под влиянием oligoRING-фрагмента 145
5.1.4 Анализ микросрезов гусениц непарного шелкопряда, контактно обработанных ДНК-олигонуклеотидами 155
5.2 Заражённые ВЯП НШ гусеницы непарного шелкопряда 166
5.2.1 Снижение экспрессии антиапоптозных генов системы взаимоотношений вирус-хозяин под действием oligoRING-фрагмента антиапоптозного IAP-3 гена ВЯП НШ 166
5.2.2 Детекция апоптотической "ДНК-лестницы" в заражённых ВЯП НШ гусеницах непарного шелкопряда, обработанных одноцепочечными ДНК фрагментами 172
Раздел 6 ДНК-инсектицид на основе антисмыслового фрагмента гена, кодирующего 5,8S рибосомальную РНК 178
6.1 Антисмысловой oligoRIBO-11-фрагмент проникает в клетки гусениц непарного шелкопряда 179
6.2 Антисмысловой oligoRIBO-11-фрагмент вызывает смертность гусениц непарного шелкопряда, выращенных в лаборатории и устойчивых к oligoRING-инсектициду 184
6.3 OligoRIBO-11-фрагмент снижает концентрацию 5,8S рРНК в клетках гусениц непарного шелкопряда 188
6.4 Свидетельства снижения уровня биосинтеза белка в тканях гусениц непарного шелкопряда, обработанных oligoRIBO-11-фрагментом 190
Раздел 7 Избирательность действия ДНК-инсектицидов на основе коротких антисмысловых фрагментов антиапоптозных генов 193
7.1 Биоразлагаемость oligoRIBO-11-фрагмента и oligoRING-фрагмента с участием тканевых дезоксирибонуклеаз 193
7.2 Нецелевые насекомые 198
7.3 Нецелевые растения 208
7.4 Стволовые клетки быка домашнего 216
Заключение 226
Список условных сокращений и обозначений 231
Список литературы 233
