Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Строение молекул антител. Структура генов иммуноглобулинов 9
1.2 Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител 13
1.3 Трансгенные растения как продуценты рекомбинантных белков 19
1.4 Внутриклеточная сортировка белков. Роль эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в посттрансляционной модификации белков. Механизмы секреции белков 21
1.5 Получение антител в трансгенных растениях 30
1.5.1 Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений 32
1.5.2 Экспрессия scFv - фрагментов антител в различных компартментах растительной клетки 42
1.5.3 Биотехнологические аспекты производства антител в растительных системах 49
1.6 Использование бактериальных белков барназы и барстара в
молекулярной биологии и физиологии растений 54
2 Материалы и методы 62
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 62
2.1.1 Условия культивирования бактерий 62
2.2 Растения 63
2.2.2 Условия культивирования растений 63
2.3Растворы, использованные в работе 64
2.4 Ферменты, использованные в работе 65
2.5 Другие растворы и буферы 66
2.6 Другие реактивы и материалы 67
2.7 Основное обрудование 68
2.8 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК 69
2.9 Конструирование плазмид для трансформации растений 69
2.10 Введение метки в ДНК 71
2.11 Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах 71
2.12 Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 72
2.13 Гибридизация на фильтрах по Саузерну 73
2.14 Трансформация листовых дисков табака 73
2.15 Выделение суммарной растительной ДНК 74
2.16 ПЦР-анализ трансгенных растений 75
2.17 Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола 75
2.18 РНК-ДНК гибридизация 76
2.19 Получение и анализ белковых экстрактов трансгенных растений и клеточных культур 77
2.20 Аффинная очистка scFvFllbarstar 79
2.21 Определение функциональной активности рекомбинантных антител 80
2.22 Иммунофлуоресцентная микроскопия 81
2.23 Получение суспензионной клеточной культуры 82
3. Результаты и их обсуждение 84
3.1 Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar 84
3.1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar под контролем двойного промотора 35SCaMV 84
3.1.2 Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum конструкциями на основе гена scFvFl lbarstar 94
3.2 Молекулярно-генетический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFl lbarstar 95
3.3 Иммунохимический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFllbarstar 99
3.4 Иммуновизуализация scFvFl lbarstar в тканях листа 104
3.5 Анализ поколения F1 растений, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFl lbarstar 106
3.6 Аффинная очистка scFvFllbarstar из трансгенных растений и определение функциональной активности очищеных антител 110
3.7 Характеристика суспензионной клеточной культуры Nicotiana tabacco-продуцента мини-антител 117
Заключение 123
Выводы 125
Список литературы
