Введение
Глава 1. Обзор литературных источников 10
1.1. Биологические особенности вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza) 10
1.2. Особенности индукции морфогенеза Lemnaceae 12
1.3. Методы трансформации растений
1.3.1. Агробактериальный метод трансформации растений 15
1.3.2. Биолистический метод трансформации растений
1.4. Методы генетической трансформации Lemnaceae 21
1.5. Особенности векторных конструкций, используемых для трансформации растений 25
1.5.1. Промотор 25
1.5.2. Интрон 26
1.5.3.Терминатор 26
1.5.4.Репортерный ген 27
1.5.5. Селективный ген 28
1.6. Lemnacea как экспрессионная платформа для биофарминга 30
1.7. Технология ферментационных процессов
1.7.1. Технология выращивания культур растительных клеток 35
1.7.2. Принцип действия биореакторов 38
1.7.3. Конструкция биореакторов
1.7.3.1. Система перемешивания 40
1.7.3.2. Система теплообмена 42
1.7.3.3.Система пеногашения 43
1.7.3.4. Система контроля кислотности 44
1.7.3.5. Система контроля парциального давления растворнного газа 44
1.7.3.6. Система стерилизации 45
1.7.4. Lemnaceae как объект культивирования в биореакторе 46
1.8. Питательные среды 48
1.8.1. Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов 48
1.8.1.1. Неорганические составляющие сред 48
1.8.1.2. Органические составляющие сред 50
1.8.2.Типы питательных сред 51
1.9. Заключение по обзору литературы 52
Глава 2. Экспериментальная часть 54
2.1. Материалы и методы 54
2.1.1. Объекты исследования 54
2.1.2. Подготовка и приготовление сред 54
2.1.3. Генетическая трансформация 54
2.1.3.1. Биолистическая трансформация 54
2.1.3.1.1. Векторная конструкция для биолистической трансформации вольфии. 54
2.1.3.1.2. Подготовка ДНК и обстрел микрочастицами 56
2.1.3.1.3. Методика биолистической трансформации вольфии 56
2.1.3.1.4. Флуоресцентный анализ активности гена gfp 57
2.1.3.2. Агробактериальная трансформация 57
2.1.3.2.1. Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные вектора 57
2.1.3.2.2. Методика агробактериальной трансформации вольфии 58
2.1.3.2.3. Селекция трансгенных тканей 59
2.1.3.2.4. Гистохимический анализ активности гена uidA 60
2.1.3.3. Расчет эффективности трансформации 60
2.1.4. Молекулярно-генетический анализ трансгенных образцов вольфии .. 61
2.1.4.1. Выделение тотальной растительной ДНК 61
2.1.4.2. ПЦР-анализ трансгенных растений 62
2.1.4.3. Визуализация продуктов ПЦР 64
2.1.4.4. Выделение тотальной растительной ДНК в препаративных количествах 64
2.1.4.5. Саузерн блот анализ 65
2.1.5. Количественный анализ содержания белка 66
2.1.5.1. Выделение тотального водорастворимого белка 66
2.1.5.2. Определение концентрации белка, метод Мерион Бредфорд
2.1.6. Технические параметры биореакторов 68
2.1.7. Методика подготовки посевной дозы для биореактора 68
2.1.8. Физическое моделирование методом Монте-Карло 70
2.1.9. Построение и решение оптимизационных моделей средствами программ MSExcel 71
2.1.10. Статистическая обработка данных 72
2.2. Результаты и обсуждение 73
2.2.1. Изучение условий, влияющих на рост эксплантов вольфии в условиях in vitro 73
2.2.1.1. Индукция каллусообразования вольфии бескорневой 73
2.2.1.2. Субкультивирование каллусных структур вольфии бескорневой 95
2.2.1.3. Регенерация вольфии бескорневой 96
2.2.1.4. Цикл культивирования экспланов вольфии бескорневой 97
2.2.2. Определение концентраций селективных агентов для селекции трансгенных клеток и тканей 100
2.2.3. Генетическая трансформация вольфии бескорневой 103
2.2.3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность биолистической трансформации вольфии бескорневой 103
2.2.3.2. Изучение факторов, влияющих на эффективность агробактериальной трансформации вольфии бескорневой 105
2.2.4. Разработка режима культивирования вольфии бескорневой 111
2.2.4.1. Компоненты питательных сред как факторы повышения продуктивности вольфии 111
2.2.4.2. Моделирование индивидуально-сбалансированной среды для культивирования вольфии бескорневой 120
2.2.4.3. Абиотические условия культивирования как факторы повышения продуктивности вольфии 128
2.2.5. Глубинное культивирование вольфии бескорневой (Wolffia
arrhiza) 131
2.2.5.1. Модификация узлов биореактора 131
2.2.5.2. Глубинное культивирование вольфии в биореакторе 137
Заключение 140
Выводы 142
Библиографический список
