Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Эстеразы крови и методы их определения 12
1.1.1. Эстеразы крови и здоровье человека 12
1.1.1.1. Ацетилхолинэстераза 12
1.1.1.2. Бутирилхолинэстераза 17
1.1.1.3. Карбоксилэстераза 20
1.1.2. Методы определения активностей эстераз крови 24
1.1.3.1. Методы определения эстераз 24
1.1.3.2. Методы определения эстераз в смеси 29
1.1.3.3. Мультисенсоры как новый подход к проведению ферментативного анализа 31
1.2. Метод послойного нанесения полиэлектролитов как перспективный подход к созданию биосенсоров 36
1.2.1. Метод послойного нанесения полиэлектролитов 36
1.2.2. Холиноксидаза и биосенсоры на ее основе 3 8
1.2.3. Тирозиназа и биосенсоры на ее основе 40
1.2.4. Тирозиназный и холиноксидазный биосенсоры, созданные в лаборатории Экобиокатализа 41
1.2.5. Полимеры в методе послойного нанесения полиэлектролитов 44
1.3. Строение, синтез и свойства полимерных звезд 51
1.3.1. Строение и синтез полимерных звезд 51
1.3.2. ATRP-полимеризация 52
1.3.3. Синтез и свойства полианионной звезды 53
1.3.4. Синтез и свойства поликатионной звезды 56
1.3.5. Моделирование поведения полимерных звезд в водных растворах 61
1.4. Алкогольоксидаза и биосенсоры на ее основе 61
1.4.1. Структура и свойства алкогольоксидазы 67
1.4.1.1. Особенности структуры алкогольоксидазы 68
1.4.1.2. Свойства алкогольоксидазы 69
1.4.2. Биосенсоры на основе алкогольоксидазы 72
1.4.2.1. Амперометрические сенсоры на основе алкогольоксидазы 73
1.4.2.2. Методы иммобилизации алкогольоксидазы при изготовлении амперометрических сенсоров 78
2. Экспериментальная часть 85
2.1. Материалы 85
2.2. Методы 86
2.2.1. Изготовление тирозиназных биосенсоров 86
2.2.2. Электромодификация графитовых электродов МпОг 87
2.2.3. Изготовление холиноксидазных биосенсоров 88
2.2.4. Приготовление образцов для АСМ 89
2.2.5. Получение АСМ-изображений 89
2.2.6. Обработка топографии поверхностей 90
2.2.7. Спектрофотометрическое определение активностей холинэстераз 90
2.2.8. Титрование активных центров холинэстераз 90
2.2.9. Электрохимический анализ фенола и холина в одпоэлектродной ячейке 93
2.2.10. Циклическая вольтамперометрия 93
2.2.11. Электрохимический анализ фенола и холина в двухэлектродной ячейке 93
2.2.12. Одновременное определение скорости ферментативного гидролиза холиновых и фениловых эфиров под действием холинэстераз 94
2.2.13. Квазиупругое динамическое светорассеяние 94
2.2.14. Определение активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах 94
2.2.15. ИК-спектроскопия 95
2.2.16. Изготовление алкогольоксидазных биосенсоров ; 95
2.2.17. Определение активности алкогольоксидазных биосенсоров 96
2.2.18. Обработка результатов 96
3. Результаты и обсуждение 98
3.1. Использование электрохимических биосенсоров на основе тирозиназы и холиноксидазы для анализа эстераз в смеси 101
3.1.1. Стабилизация тирозиназных и холиноксидазных электродов, изготовленных по методу послойного нанесения полиэлектролитов 102
3.1.1.1. Стабилизация тирозиназного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 103
3.1.1.1. Стабилизация холиноксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 109
3.1.2. Оптимизация условий одновременного электрохимического определения фенола и холина 112
3.1.2.1. Оптимизация рабочего потенциала холиноксидазного электрода 113
3.1.2.2. Влияние холиновьгх и фениловых эфиров на электрохимическое определение фенола и холина 114
3.1.3. Определение холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродного электрохимического биосенсора 115
3.1.3.1. Определение коэффициентов чувствительности холинэстераз по выбранным субстратам 115
3.1.3.2. Дискриминационный анализ холинэстераз в смеси 122
3.2. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для создания электрохимических биосенсоров 126
3.2.1. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для улучшения аналитических характеристик тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров 126
3.2.1.1. Взаимодействие тирозиназы и холиноксидазы с полиэлектролитами нелинейной архитектуры в водных растворах 126
3.2.1.2. Влияние полимерных звезд на активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах 127
3.2.1.3. ИК-спектры комплексов тирозиназы и холиноксидазы с, полимерными звездами 128
3.2.1.4. Электроды, полученные на основе комплексов ферментов с полимерными звездами 130 -
3.2.1.5. Электроды различных конструкций на основе холиноксидазы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры 132
3.2.1.6. Электроды различных конструкций на основе тирозиназы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры 134
3.2.2. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов 142
3.2.2.1. Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурнрованных пленок полиэлектролитов 142
3.2.2.2. Оптимизация методики изготовления алкогольоксидазных биосенсоров 145
3.2.2.2.1. Выбор оптимальной концентрации алкогольоксидазы, используемой для создания сенсоров 146
3.2.2.2.2. Оптимизация состава биосенсоров по типу поликатиона 148
3.2.2.3. Оптимизация условий количественного определения этилового спирта 149
3.2.2.3.1. Оптимизация рН рабочего буфера 149
3.2.2.3.2. Влияние ионной силы рабочего буфера на активность сенсоров 151
3.2.2.4. Исследование операционной стабильности алкогольоксидазного биосенсора 151
3.2.2.5. Определение кинетических характеристик алкогольоксидазы, иммобилизованной по методу послойного нанесения полиэлектролитов 154
3.2.2.6. Определение аналитических характеристик алкогольоксидазного сенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 156
Заключение 158
Выводы 159
Литература 161
