Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Бактерии Bacillus thuringiensis, основные факторы вирулентности и механизм действия 19
1.2. Энтомопатогенные грибы Metarhizium robertsii и Beauveria bassiana 27
1.3. Механизмы резистентности насекомых к бактериальным и грибным инфекциям 31
1.3.1. Внешние системы защиты насекомых 31
1.3.1.1. Покровы 31
1.3.1.2. Кишечник 35
1.3.2. Реакции клеточного и гуморального иммунитета 39
1.3.2.1. Клеточные иммунные реакции 39
1.3.2.2. Гуморальные иммунные реакции 43
1.3.3. Антиоксидантная и детоксицирующая системы 50
1.4. Заключение 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Насекомые 63
2.2. Энтомопатогенные микроорганизмы 63
2.2.1. Бактерии 63
2.2.1.1. Заражение насекомых бактериями и моделирование сублетальной и полулетальной инфекции 64
2.2.1.2. Селекция насекомых на устойчивость к бактериям B. thuringiensis 64
2.2.2. Грибы 65
2.2.2.1. Заражение грибами 66
2.2.2.2. Селекция на устойчивость к грибу B. bassiana 66
2.2.3. Характеристики адгезии и роста грибов на насекомых 67
2.2.3.1. Уровень адгезии конидий на кутикуле насекомых 67
2.2.3.2. Уровень прорастания конидий на кутикуле насекомых и ее экстрактах 68
2.2.3.3. Определение гриба в гемолимфе насекомых 69
2.2.4. Анализ микрофлоры в кишечнике насекомых 69
2.3. Изучение защитных систем насекомых 70
2.3.1. Приготовление образцов тканей и органов 70
2.3.2. Измерение толщины кутикулы 72
2.3.3. Оценка активности реакций клеточного и гуморального иммунитета
2.3.3.1. Определение активности фагоцитоза 72
2.3.3.2. Определение интенсивности инкапсуляции 73
2.3.3.3. Определение активности фенолоксидаз в гемоцитах 73
2.3.3.4. Определение активности фенолоксидаз в плазме гемолимфы 74
2.3.3.5. Подсчет общего количества гемоцитов в гемолимфе 74
2.3.3.6. Определение лизоцим-подобной антибактериальной активности 75
2.3.3.7. Определение индекса коагуляции гемолимфы 75
2.3.4. Оценка активности антиоксидантной и детоксицирующей систем 76
2.3.4.1. Определение активности каталазы 76
2.3.4.2. Определение активности супероксиддисмутазы 76
2.3.4.3. Определение концентрации тиолсодержащих соединений 77
2.3.4.4. Определение активности глутатион-S-трансфераз 77
2.3.4.5. Измерение концентрации малонового диальдегида 78
2.3.4.6. Оценка генерации активированных кислородных метаболитов 78
2.3.5. Определение концентрации белка 79
2.3.6. Оценка уровня экспрессии различных генов в кишечнике, жировом теле и покровах насекомых 79
2.3.7. Подавление экспрессии (сайленсинг) различных генов защитной системы с помощью РНК интерференции
2.4. Измерение показателей индивидуального развития насекомых и популяционных характеристик 82
2.5. Реактивы 82
2.6. Статистическая обработка данных 82
ГЛАВА 3. Основные защитные механизмы вощинной огневки при развитии резистентности к бактериям B. thuringiensis 84
3.1. Бактериальный патогенез и развитие резистентности к B. thuringiensis 86
3.2. Вес куколок и плодовитость вощинной огневки при формировании резистентности к B. thuringiensis 93
3.3. Активация бактериальных Cry-токсинов и их связывание с рецепторами в кишечнике насекомых 94
3.4. Процессы регенерации и репарации в кишечнике насекомых при бактериозе B. thuringiensis 100
3.5. Иммунный ответ насекомых при бактериозе B. thuringiensis
3.5.1. Реакции клеточного и гуморального иммунитета у насекомых при заражении бактериями B. thuringiensis 102
3.5.2. Показатели иммунитета у линий вощинной огневки с различной чувствительностью к B. thuringiensis 117
3.6. Окислительно-восстановительный баланс у насекомых при бактериозе B. thuringiensis 127 3.6.1. Роль антиоксидантной системы в кишечнике при бактериозе B. thuringiensis 127
3.6.2. Окислительно-восстановительный баланс в кишечнике и жировом теле насекомых с различной чувствительностью к B. thuringiensis 135
3.6.3. Уровень экспрессии белков теплового шока при бактериозе B. thuringiensis 145
3.7. Состав микрофлоры кишечника насекомых при бактериозе вызываемом B. thuringiensis 149
Заключение к главе 3 153
ГЛАВА 4. Внутривидовая микроэволюционная стратегия устойчивости вощинной огневки против энтомопатогенных грибов B. bassiana 158
4.1. Восприимчивость меланистической и ахромистической морф вощинной огневки к грибам B. bassiana 160
4.2. Кутикулярные защитные механизмы меланистической и ахромистической морф 162
4.3. Клеточный и гуморальный иммунный ответ личинок меланистической и ахромистической морф 166
4.4. Морфометрические и популяционные показатели насекомых меланистической и ахромистической морф 173
Заключение к главе 4 174
ГЛАВА 5. Формирование механизмов резистентности к микроорганизмам уличинок вощинной огневки G. mellonella при направленном отборе на устойчивость к B. bassiana 179
5.1. Селекция насекомых на устойчивость грибу B. bassiana и восприимчивость селектированной линии к энтомопатогенным грибам 179
5.2. Иммунный ответ у личинок линии вощинной огневки селектированной на устойчивость к грибу B. bassiana 182
5.3. Морфометрические и популяционные показатели линии вощинной огневки устойчивой к грибу B. bassiana 196
Заключение к главе 5 198
Заключение 203
Выводы 213
Список сокращений 216
Список литературы
