Введение
Глава 1. Карбогидразы, их классификация и биологическая характеристика. Гидролиз олиго- и полисахаридов 12
1.1. Общие закономерности ферментативного гидролиза олиго-и полисахаридов 12
1.2. Характеристика отдельных представителей карбогидраз и их субстратов 12
1.3. Микробный синтез карбогидраз 23
1.4. Конститутивная и индуцибельная природа карбогидраз. Индукция и репрессия синтеза 30
1.5. Физико-химические свойства карбогидраз 36
1.6. Современные представления о структуре карбогидраз 42
1.7. Структура активных центров карбогидраз 56
1.8. О механизе расщепления гликозидных связей под действием карбогидраз 65
1.9. Перспективы практического применения карбогидраз 68
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследований 75
2.1. Объекты исследований
2.1.1. Культивирование ацетонобутиловых бактерий 75
2.1.2. Культивирование продуцентов |3-галактозидазы 76
2.1.3. Культивирование микромицетов - продуцентов (3-фруктофуранозидазы и инулиназы 77
2.2. Определение активности гликозидаз
2.2.1. Определение активности сс-амилазы 77
2.2.2. Определение активности глюкоамилазы 78
2.2.3. Определение активности (3-галактозидазы 79
2.2.4. Определения активности инулиназы 80
2.2.5. Определение активности |3-фруктофуранозидазы 81
2.3. Приготовление субстратов 82
2.4. Выделение и очистка карбогидраз 84
2.4.1. Получение спиртоосажденных ферментных препаратов 84
2.4.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 84
2.4.3. Ультрафильтрация 85
2.4.4. Ионообменная колоночная хроматография 86
2.4.5. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 86
2.4.6. Электрофорез 87
2.4.7. Очистка инулиназы 87
2.5. Кристаллизация инулиназы А. awamori-2250 88
2.6. Определение молекулярной массы ферментов 90
2.7. Определение мРНК и аминокислотной последовательности инулиназы 91
2.8. Идентификация аминокислотных остатков 92
2.8.1. Модификация имидазольной группы диэтилпирокарбонатом 92
2.9. Методы контроля ацетонобутилового брожения 93
2.10. Общие методы 94
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных 94
Глава 3. Биосинтез карбогидраз микроорганизмами
3.1. Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез карбогидраз при глубинном культивировании микроорганизмов 96
3.2. Влияние влажности питательной среды и крахмалистости отрубей на биосинтез карбогидраз при поверхностном культивировании 110
3.3. Влияние некоторых физико-химических факторов на биосинтез карбогидраз 114
Глава 4. Препаративное получение карбогидраз и исследование их физико-химических свойств 128
4.1. Очистка а-амилазы и глюкоамилазы CI. acetobutylicum 128
4.2. фракционирование и очистка (3-галактозидазы и Р-фруктофуранозидазы 135
4.3. Очистка и кристаллизация инулиназы а. awamori-2250 138
4.4. Исследование каталитических свойств карбогидраз 143
4.4.1. Оптимальные значения рН и температуры для действия карбогидраз 144
4.5. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации карбогидраз 149
4.5.1. Влияние рН на стабильность а-амилазы Clostridium acetobutylicum 149
4.5.2. Термическая инактивация а-амилазы 154
4.5.3. Кислотная и термическая инактивация глюкоамилазы, инулиназы, (3-галактозидазы и (3-фруктофуранозидазы 157
4.5.4. Термодинамические характеристики процесса инактивации карбогидраз 162
Глава 5. Особенности структуры активного центра карбогидраз и механизма их каталитического действия 167
5.1. Нуклеотидная последовательность мРНК и аминокислотная последовательность инулиназы 167
5.1.2. Гликозилирование карбогидраз 176
5.2. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз 179
5.2.1. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз по кривым зависимости активности от рН 179
5.2.2. Теплота ионизации каталитически активных групп карбогидраз 182
5.2.3. Идентификация имидазольной группы карбогидраз фотоокислением 183
5.2.4. Ингибирование специфическими реагентами 187
5.3. Исследование механизма ферментативного катализа олиго- и полисахаридов 190
5.4. Специфичность действия карбогидраз 199
5.4.1. Кинетика действия и субстратная специфичность инулиназы А. awamori 206
Глава 6. Применение карбогидраз в пищевой промышленности и биотехнологии 218
6.1. Применение амилолитических ферментов для снижения вязкости сбраживаемых сред в процессе ацетонобутилового брожения 218
6.2. Получение и применение биогидролизатов лактозных сиропов 223
6.3. Ферментативный гидролиз инулинсодержащего сырья 229
6.4. Использование инулиназы при сбраживании топинамбура в этанол 238
6.5. Сбраживание топинамбура дрожжами рода Kluyveromyces 240
Общие выводы 245
Список литературы 248
Приложения
