Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Липоксигеназы растений 12
1.1.1. Липоксигеназная реакция и субстратные предпочтения 15
1.1.2. Модели специфичности действия липоксигеназ 22
1.1.3. Ренгеноструктурный анализ липоксигеназ 27
1.1.4. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3) 32
1.2. Липоксигеназная сигнальная система растений 33
1.2.2. Алленоксидсинтазный путь 37
1.2.3. Гидропероксидлиазный путь 40
1.2.4. Дивинилэфирсинтазный путь 42
1.3. Постановка цели исследования 45
Глава II. Материалы и методы 47
2.1. Получение продуцентов рекомбинантных ферментов 47
2.2. Полимеразная цепная реакция 50
2.3. Сайт-направленный мутагенез 52
2.4. Определение нуклеотидной последовательности 53
2.5. Получение рекомбинантного фермента 54
2.7. Кинетические исследования 57
2.8. Дериватизация продуктов реакции 58
2.9. Высокоэффективная жидкостная хроматография 58
2.10. Масс-спектрометрические исследования 58
Глава III. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Получение рекомбинатного фермента ZmLOX3 60
3.1.1. Экспрессия и лизис культуры-продуцента 60
3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента 62
3.1.3. Стабильность рекомбинантного фермента ZmLOX3 64
3.2. Окисление свободных жирных кислот 67
3.2.1. Окисление линолевой кислоты при участии ZmLOX3 67
3.2.2. Окисление высших гомологов линолевой кислоты при участии ZmLOX3 и GmLOXl 70
3.2.3. Окисление жирных кислот гексадеканового ряда при участии ZmLOX3 и GmLOXl 74
3.2.4. Особенности окисления свободных жирных кислот при участии ZmLOX3 и GmLOX 76
3.3. Гексадеканоидный путь в растениях 80
3.3.1. Идентификация производных 16:3 в растениях in vivo 80
3.3.2. Участие (7і!>)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути 84
3.4. Сайт-направленный мутагенез ZmLOX3 86
3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOX3 86
3.4.3. Окисление линолевой кислоты при участии мутантных форм ZmLOX3 88
3.4.4. Окисление сложных липидов при участии ZmLOX3 дикого типа и ее мутантной формы Ala562Gly 94
3.4.1. Трехмерная модель ZmLOX3 98
3.5. Модель позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ 100
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
