ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.................................................................................... 8
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................ 11
Актуальность проблемы ........................................................................................... 11
Цель и задачи исследования..................................................................................... 15
Научная и практическая значимость....................................................................... 16
Внедрение полученных результатов в практику ................................................... 21
Методология и методы исследования..................................................................... 22
Достоверность результатов. ..................................................................................... 23
Положения, выносимые на защиту: ........................................................................ 23
Апробация работы..................................................................................................... 24
Соответствие диссертации паспорту научной специальности............................. 25
Публикации................................................................................................................ 25
Объем и структура диссертации.............................................................................. 25
Личный вклад автора. ............................................................................................... 26
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 28
1.1 Моноклональные антитела их виды и модификации...................................... 28
1.2 Особенности молекулярной структуры однодоменных антител................... 32
1.3 Технология получения однодоменных антител............................................... 34
1.4 Применение однодоменных антител в диагностике. ...................................... 47
1.5 Применение однодоменных антител в терапии............................................... 54
1.6 Вирус Эбола. Выбор мишени для нейтрализующих однодоменных антител.
..................................................................................................................................... 63
1.7 Коронавирус SARS-Cov-2. Выбор мишени для разработки средства терапии
заболевания COVID-19............................................................................................. 69
1.8 Ботулизм. Роль ботулотоксина А (BonT/A) C.botulinum в развитии
ботулизма ................................................................................................................... 78
1.9 C.difficile, роль токсина В (TcdB) в развитии патологий ассоциированных с
C. difficile (антибиотикоопосредованные диареи (АОД) и псевдомембранозный
колит (ПМК)) ............................................................................................................. 84
1.10 Mycoplasma hominis и ее роль в патогенезе урогенитальной инфекции
человека...................................................................................................................... 90
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................. 93
2.1. Материалы, использованные в диссертационной работе .............................. 93
2.1.1 Оборудование ................................................................................................... 93
2.1.2. Микроорганизмы и рекомбинантные вирусные векторы........................... 95
2.1.3. Линии клеток млекопитающих, использованные в диссертационной
работе.......................................................................................................................... 97
2.1.4 Животные .......................................................................................................... 98
2.1.5. Плазмидные векторы. ..................................................................................... 98
2.1.6. Антитела......................................................................................................... 100
2.1.7. Рекомбинантные белки................................................................................. 101
2.1.8. Различные реактивы для молекулярно-биологических процедур ........... 101
2.1.9. Среды для культивирования бактерий........................................................ 101
2.1.10. Среды для культивирования эукариотических клеток и реактивы для
трансфекции............................................................................................................. 102
2.1.11. Наборы.......................................................................................................... 103
2.1.12. Синтез нуклеотидных последовательностей, секвенирование .............. 104
2.1.13. Реактивы, используемые в иммунобиологических методах .................. 104
2.2. МЕТОДЫ .......................................................................................................... 105
2.2.1 Получение антигенов для иммунизации...................................................... 105
2.2.1.1 Культивирование M.hominis и выделение фракции ЛАМБ.................... 105
2.2.1.2 Получение нетоксичной субъединицы CROPS токсина B C.difficile. ... 106
2.2.1.3 Выделение ботулотоксина А C.botulinum................................................. 107
2.2.1.4. Получение рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, несущего ген
белка GP вируса Эбола (rAd5-GP) и рекомбинантного вируса везикулярного
стоматита, псевдотипированного белком GP вируса Эбола (rVSV-GP) ........... 108
2.2.1.5 Получение рекомбинантного белка рецептор-связывающего домена
(RBD) коронавируса SARS-Cov-2 ......................................................................... 109
2.2.2 Получение иммунных библиотек однодоменных антител ........................ 111
2.2.2.1 Иммунизация, отбор крови и выделение лимфоцитов............................ 111
2.2.2.2 Выделение РНК из лимфоцитов и синтез кДНК. .................................... 113
2.2.2.3 ПЦР-амплификация последовательностей VHH ..................................... 114
2.2.2.4 Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN1 и
получение библиотеки клонов-трансформантов ................................................. 115
2.2.2.5 Получение библиотеки бактериофагов..................................................... 116
2.2.3 Проведение селекции бактериофагов, несущих на поверхности
специфичные VHH (биопаннинг).......................................................................... 117
2.2.4 Анализ специфичности клонов однодоменных антител методами Фаг-
ИФА и VHH-ИФА................................................................................................... 119
2.2.5 Получения белковых препаратов однодоменных антител ........................ 121
2.2.6 Определение аффинности клонов однодоменных антител методом
плазмонного резонанса и оптической интерференции ....................................... 122
2.2.7 Оценка нейтрализующей активности однодоменных антител в отношении
токсина В C.difficille................................................................................................ 123
2.2.8 Получение однодоменных антител в форме димеров и слитых с Fc-
фрагментами иммуноглобулина G. ....................................................................... 124
2.2.9 Оценка протективной активности однодоменных антител на модели
летальной интоксикации ботулотоксином in vivo. .............................................. 125
2.2.10 Модель вагинальной инфекции M. hominis. .............................................. 126
2.2.11. Оценка нейтрализующей активности однодоменных антител,
специфичных белку GP вируса Эбола методом определения титра антител,
вызывающего 50%-е снижение количества бляшек на инфицированном
вирусом монослое культуры клеток...................................................................... 127
2.2.12 Изучение фармакокинетики однодоменных антител............................... 127
2.2.13 Анализ нейтрализующей активности однодоменных антител в
отношении коронавируса SARS-CoV-2 методом микронейтрализации........... 128
2.2.14 Исследование протективности однодоменных антител на модели
летальной инфекции SARS-Cov-2 на мышах....................................................... 129
2.2.15. Доклинические исследования безопасности............................................ 130
2.2.16 Клинические исследования ......................................................................... 131
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................................... 132
3.1 Универсальная технологическая платформа, позволяющая разрабатывать
препараты для терапии и диагностики инфекционных заболеваний на основе
однодоменных антител 135
3.2. Получение молекул на основе неканонических однодоменных антител и их
модификаций для экстренной профилактики и терапии инфекционных
заболеваний.............................................................................................................. 133
3.2.1. Получение однодоменных антител обладающих нейтрализующей
активностью в отношении вируса Эбола.............................................................. 136
3.2.1.1 Получение панели рекомбинантных антител, специфичныхк EBOV GP
................................................................................................................................... 138
3.2.1.2 Оценка аффинности и нейтрализующей активности отборанных клонов
антител...................................................................................................................... 144
3.2.1.3 Получение модифицированных моноклональных антител, содержащих
Fс-фрагмент IgG1 человека и изучение их вируснейтрализующих свойств .... 146
3.2.1.4 Оценка протективной активности антител на модели летальной
инфекции мышей rVSV-GP.................................................................................... 153
3.2.1.5 Оценка протективной активности антител на модели летальной
инфекции макак-резусов вирусом лихорадки Эбола .......................................... 156
3.2.1.6 Доклинические исследования безопасности и фармакокинетики
препарата ГамЭзумаб.............................................................................................. 159
3.2.1.7 Клинические исследования безопасности и фармакокинетики препарата
ГамЭзумаб на здоровых добровольцах................................................................. 169
3.2.2. Разработка препарата на основе однодоменных антител для экстренной
профилактики и этиотропной терапии COVID-19 .............................................. 174
3.2.2.1 Проведение иммунизации и отбор клонов однодоменных антител,
специфических рецептор-связывающему домену (RBD) S-гликопротеина
SARS-Cov-2.............................................................................................................. 176
3.2.2.2 Анализ вируснейтрализующей активности однодоменных антител и
изучение ее механизма............................................................................................ 181
3.2.2.3 Получение молекул VHH, содержащих различные модификации и
оценка их противовирусной активности in vitro и in vivo. ................................. 186
3.2.2.4 Разработка препарата ГамКовиМаб - антитела моноклональные для
экстренной профилактики и ранней этиотропной терапии коронавирусной
инфекции, раствор для инфузий ............................................................................ 189
3.2.2.5. Открытое исследование безопасности и фармакокинетики
лекарственного препарата для ранней этиотропной терапии коронавирусной
инфекции, вызываемой вирусом SARS-СoV-2, при однократном применении у
здоровых добровольцев в 3 группах с эскалацией дозы..................................... 202
3.2.3. Разработка препарата на основе модифицированных однодоменных
антител для терапии интоксикации, вызванной ботулотоксином. .................... 216
3.2.3.1. Выделение антигенного материала проведение иммунизации альпак 216
3.2.3.2 Получение библиотеки однодоменных антител специфичных
ботулотоксину и предварительная оценка нейтрализующей активности......... 218
3.2.3.3. Отбор индивидуальных клонов VHH и оценка их нейтрализующей
активности................................................................................................................ 220
3.2.3.4. Модификация клонов однодоменных антител для усиления их
протективной активности....................................................................................... 221
3.2.4 Получение однодоменных антител и их модификаций, специфичных к
токсину B Clostridioides difficile и обладающих нейтрализующей активностью
................................................................................................................................... 226
3.2.4.1. Проведение иммунизации животных семейства Camelidae нетоксичным
производным токсина В C. difficile........................................................................ 227
3.2.4.2. Проведение селекции и отбор клонов VHH, специфически
связывающихся с CROPs доменом токсина В C. difficile ................................... 230
3.2.4.3 Изучение нейтрализующей активности наиболее аффинных
однодоменных антител в отношении токсина В C. difficile................................ 237
3.3 Получение молекул на основе неканонических однодоменных антител и их
модификаций для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов
................................................................................................................................... 240
3.3.1.1 Получение и характеристика неканонических однодоменных антител
для детекции M.hominis различными методами .................................................. 241
3.3.1.2 Идентификация мишени для антител aMh06........................................... 251
3.3.1.3 Изучение диагностического потенциала препаратов на основе aMh06 для
детекции M. hominis ................................................................................................ 254
3.3.1.4. Генетическая пассивная иммунизация для защиты от урогенитальной
инфекции, вызванной M. hominis........................................................................... 261
3.3.2. Разработка биосенсоров на основе неканонических однодоменных
антител для детекции токсина Clostridioides difficile методом плазмонного
резонанса .................................................................................................................. 271
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................ 285
Заключение 321
Выводы ..................................................................................................................... 319
Список литературы ................................................................................................. 321
