Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Болезнь альцгеймера 7
1.2 Фронто-темпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 12
1.3 Гипотезы нейрональной дегенерации при болезни альцгеймера и фронто-темпоральных деменциях, связанных с хромосомой 17 14
1.4 ассоциированный с микротрубочками белок TAU 19
1.4.1 Белки, ассоциированные с микротрубочками 19
1.4.2 Структура белка tau 19
1.4.3 Функции белка tau 20
1.5 Образование агрегатов белка TAU 22
2. Цели и задачи исследования 27
3. Материалы и методы 28
3.1 Микробиологические методы 28
3.1.1 Культивирование бактерий 28
3.1.2 Приготовление электрокомпетентных клеток 29
3.1.3 Трансформация компетентных клеток 29
3.2 Молекулярно-генетические методы 30
3.2.1 Выделение плазмидной ДНК 30
3.2.1.1 Минипреп 30
3.2.1.2 Максипреп 31
3.2.2 Выделение геномной ДНК из ткани хвоста мыши 31
3.2.3 Определение концентрации ДНК 32
3.2.4 Гель-электрофорез ДНК 33
3.2.5 Модификация ДНК 33
3.2.5.1 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 33
3.2.5.2 Дефосфоршшрование ДНК CIP-фосфатазой 34
3.2.5.3 Амплифицирование ДНК в полимеразной цепной реакции 34
3.2.5.4 ТОРО-клонирование 36
3.2.5.5 Выделение ДНК из агарозных гелей 36
3.2.5.6 Лигирование 37
3.2.6 Секвенирование ДНК 37
3.3 Культуры клеток 38
3.3.1 Клеточные линии 38
3.3.2 Питательные среды и пассажирование клеток 38
3.3.3 Замораживание и оттаивание клеток 39
3.3.4 Подсчет клеток в гемоцитометре 39
3.3.5 Выделение и культивирование клеток мышиных нейронов 40
3.3.6 Выделение и культивирование клеток мышиных фибробластов 41
3.3.7 Стабильная трансфекция клеток с помощью DOTAP 41
3.3.8 Иммунофлуоресценция 42
3.3.9 Тест на люциферазу 43
3.4 Биохимические методы 44
3.4.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду 44
3.4.2 Приготовление клеточных лизатов 44
3.4.3 Экстракция белка по методу Дэвиса 45
3.4.4 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле 45
3.4.5 Окрашивание гелей Coomassie Brilliant Blue R-250 46
3.4.6 Вестерн блот 47
3.4.7 Иммунное окрашивание и негативное контрастирование протеинов 48
4. Результаты 49
4.1 Клонирование 49
4.2 Стабильная экспрессия ki8, к18/дк280, к18/дк280/і277рл308р в клетках нейробластомы мыши 52
4.2.1 Экспрессия К18 и мутантов в клетках 52
4.2.2 Зависимость экспрессии tau-гена
от концентрации доксициклина 55
4.2.3 Агрегация tau 57
4.2.4 Электронная микроскопия 60
4.2.5 Окрашивание высокомолекулярных агрегатов tau с помощью тиофлавина 62
4.2.6 Ингибирование индукции путем удаления доксициклина из культуральной среды 68
4.3 Скрининг лекарственных веществ 70
4.4 Первичные нейронные культуры 70
4.5 Выявление саркозил-нерастворимых агрегатов in vivo 75
5. Обсуждение результатов 76
6. Выводы 81
7. Список литературы 83
Список принятых сокращений
