ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….6
Актуальность темы исследования……………………………………………….6
Цели и задачи работы…………………………………………………………….9
Научная новизна…………………………………………………………………10
Теоретическая и практическая значимость работы….………………………..12
Методология и методы исследования………………………………………….13
Положения, выносимые на защиту……………………………………………..13
Степень достоверности………………………………………………………….14
Личный вклад соискателя……………………………………………………….14
Апробация работы……………………………………………………………….15
Структура и объем диссертации………………………………………………..16
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………...17
1.1. Общие сведения о полиглутаминовых СЦА – определение,
классификация, клиника, эпидемиология, и лечение…………………………17
1.1.1. Общие сведения о полиглутаминовых СЦА……………………………17
1.1.2. Заболеваемость полиглутаминовыми СЦА……………………………..18
1.2.3. Клинические проявления полишлутаминовых СЦА…………………...25
1.2.4. Дифференциальный диагноз полиглутаминовых СЦА………………...29
1.2.5. Симптоматическое лечение больных с полиглутаминовыми СЦА…...30
1.2. Патогенез развития СЦА 1…………………………………………………33
1.2.1. Динамические мутации. Механизм тринуклеотидного удлинения……33
1.2.2. Гены, ответственные за развитие полиглутаминовых СЦА…………...37
1.2.3. Строение и функция нормальных полиглутаминовых белков на
примере атаксина 1 и атаксина 3……………………………………………….39
1.2.4. Строение и функция полиглутаминовой цепочки………………………45
1.2.5. Посттрансляционные изменения удлинённых полиглутаминовых
белков: влияние на нейротоксичность…………………………………………46
3
1.2.6. Теория потери функции при экспрессии мутантных полиглутаминовых
белков…………………………………………………………………………….48
1.2.7. Теория приобретения токсических функций при экспрессии мутантных
белков…………………………………………………………………………….50
1.2.8. Нарушение генетических механизмов при приобретении мутантными
полиглутаминовыми белками токсических функций …...……………………53
1.3. Клеточные нарушения……………………………………………………...57
1.3.1. mGluR1 путь передачи сигналов и его нарушение ...…………………..58
1.3.2. Нарушение морфологии КП при полиглутаминовых СЦА……………68
1.3.3. Вклад астроглии в патогенез полиглутаминовых СЦА………………...62
1.3.4. Надмолекулярные патологические механизмы. Надмолекулярные
ансамбли………………………………………………………………………….63
1.3.5. Формирование атаксического синдрома………………………………...69
1.4. Перспективы патогенетического лечения полиглутаминовых СЦА.
Экспериментальная терапия…………………………………………………….74
1.4.1. Предотвращение экспрессии мутантного гена………………………….74
1.4.2. Снижение токсичности мутантных белков……………………………...75
1.4.3. Усиление клиренса мутантных белков…………………………………..76
1.4.4. Воздействие на пути передачи сигналов………………………………...77
1.4.5. Трансплантация стволовых клеток………………………………………78
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………82
2.1. Общая характеристика исследуемого материала…………………………82
2.1.1. Экспериментальные модели……………………………………………...82
2.1.2. Подходы к патогенетическому лечению СЦА1 модельных животных.84
2.2 Методы исследования……………………………………………………….85
2.2.1. Создание вирусных векторов…………………………………………….85
2.2.2. Введение векторных конструкций……………………………………….87
2.2.3. Культивирование и ведение МСК……………………………………….89
2.2.4. Генетические методы……………………………………………………..90
4
2.2.5. Исследование поведения животных……………………………………..90
2.2.6. Вестерн-блоттинг…………………………………………………………93
2.2.7. Изготовление срезов живых тканей……………………………………..94
2.2.8. Электрофизиологические методы исследования……………………….94
2.2.9. Ca2+
имиджинг…………………………………………………………….97
2.2.10. Введение биоцитина и морфологический анализ КП…………………98
2.2.11. Статистический анализ результатов……………………………………99
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ…………101
3.1. Спектр патогенетических изменений при полиглутаминовых СЦА…..101
3.1.1. Нейрон-обусловленные нарушения в универсальной полиглутаминовой
модели…………………………………………………………………………..101
3.1.1.1. Нарушение морфологии КП в полиглутаминовой модели СЦА…...101
3.1.1.2. Нарушение синаптической пластичности КП в полиглутаминовой
модели СЦА…………………………………………………………………….104
3.1.1.3. Нарушение экспрессии RoRα в полиглутаминовой модели СЦА….110
3.1.2. Нейрон-опосредованные нарушения у СЦА1 модельных мышей…...112
3.1.2.1. Нарушение синаптической передачи у В05 СЦА1 модельных
мышей…………………………………………………………………………...113
3.1.2.2. Нарушение синаптической пластичности у В05 СЦА1 модельных
мышей…………………………………………………………………….……..115
3.1.3. Влияние ГБ на патогенез СЦА1………………………………………...131
3.1.3.1. Хроническая активация ГБ приводит к изменению её морфологии.131
3.1.3.2. Патологическая активация ГБ влияет на морфологию КП…………141
3.1.3.3. Хроническая активация ГБ изменяет синаптическую передачу в
синапсах ПВ КП………………………………………………………………..148
3.1.3.4. Экспрессия мутантного атаксина 1 в ГБ мозжечка приводит к
увеличению τ ПВ ВПСТ……………………………………………………….155
3.1.3.5. Активация ГБ вызывает нарушение кратковременной пластичности в
ПВ-КП синапсах……………………………………………………………….159
5
3.1.3.6. Экспрессия мутантного ATXN1 влияет на долговременную
синаптическую пластичность в синапсах ПВ-КП……………………………180
3.1.3.7. Патологическая активация ГБ снижает экспрессию EAAT1 в коре
мозжечка………………………………………………………….……………..181
3.2. Доставка рекомбинатных генов…………………………………………..186
3.2.1. Обоснованность использования LVV конструкций для экспрессии
таргетных генетических последовательностей………………………………186
3.2.2. Векторная экспрессия mGluR1 в КП…………………………………...193
3.2.3. Клиренс мутантных полиглутаминовых белков с помощью LVV
конструкций…………………………………………………………………….207
3.3. Введение стволовых клеток….……………………………………………222
3.4. Фармакотерапия……………………………………………………………235
3.4.1. Баклофен………………………………………………………………….235
3.4.1.1. Баклофен улучшает синаптическую передачу и пластичность в КП у
СЦА1 модельных животных…………………………………………………..235
3.4.1.2. Баклофен улучшает координацию у СЦА1 модельных животных...239
3.4.2. Мемантин………………………………………………………………...244
3.4.2.1. Выявление NMDA токов в КП………………………………………..245
3.4.2.2. Побочные эффекты мемантина……………………………………….249
3.4.2.3. Мемантин уменьшает нарушение морфологии ГБ и КП…………...260
3.4.2.4. Мемантин уменьшает нарушение синаптической передачи………..268
3.4.2.5. Мемантин предотвращает потерю EAAT1 после хронической
оптогенетической стимуляции ГБ…………………………………………….270
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..274
Заключение……………………………………………………………………...288
Выводы………………………………………………………………………….290
Практические рекомендации…………………………………………………..292
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ, ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ……….294
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...295
