Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 16
1.1 Молекулярная визуализация в онкогематологии для оценки инициального поражения, раннего ответа на терапию и остаточного заболевания у пациентов с лимфомами. Использование позитронно-эмиссионной томографии с 3 -дезокси-3 -18F-флуоротимидином в диагностики онкологических заболеваний. 16
1.2 Роль молекулярной визуализации в неинвазивной оценке новых методов лечения (адоптивная Т-клеточная терапия) при лечении онкологических заболеваний и для лечения вирусных осложнений у пациентов после ТГСК. 31
1.3 Роль ген-направленной терапии фермент пролекарство для создаваемых ген-репортерных систем. 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 55
2.1 Характеристика больных включенных в данную работу, ПЭТ и анализ результатов, клиническая оценка и наблюдение. 55
2.2 Характеристика методик использованных для выполнения in vitro и in vivo экспериментов 63
2.2.1 Ретровирусные векторы 63
2.2.2. Клеточные линии и их культивирование 64
2.2.3 Проточная цитофлуометрия и флуоресцентная микроскопия 65
2.2.4 Трансдукция и селекция Т-клеток 66
2.2.5 Анализ цитотоксической функции Т -клеток в отношении специфических клеток-мишеней 67
2.2.6 Стимуляция Jurkat клеток in vitro и in vivo 67
2.2.7 Оценка накопления радиофармпрепаратов: 2-флюоро-2 -деокси-1--D- 68 арабинофуранозил-5-этилурацила (FEAU) и пенцикловира (PCV) в трансдуцированных U87 клетках и накопления FEAU трансдуцированными Т-клетками in vitro 2.2.8 Оценка чувствительности к лекарственным препаратам 68
2.2.9 Экспериментальные группы животных 69
2.2.10 Компьютерная томография 69
2.2.11 Оценка накопления радиопроб, меченных изотопом 18F, – FEAU и 9-[4-флюоро-3-(гидроксиметил)бутил]гуанина (FHBG) 70
2.2.12 Измерение накопления радиомеченных проб в образцах тканей 70
2.2.13 Гистологический анализ 71
2.3 Статистическая обработка материала. 71
ГЛАВА 3. Результаты исследования 72
3.1 Прогностическое значение оценки инициального поражения и раннего ответа на терапию при помощи ПЭТ с 18F-ФЛТ у пациентов с неходжкинскими лимфомами 72
3.2. Создание и оценка ген-репортерных систем на основе человеческого гена деоксицитидинкиназы, для использования в клинических протоколах неинвазивной визуализации результатов клеточной терапии 79
3.2.1 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных с истем на основе деоксицитидинкиназы человека 80
3.2.2 In vivo неинвазивная оценка экспрессии химерных ген-репортерных систем на основе гена деоксицитидинкиназы человека, обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ 85
3.3 In vitro оценка и неинвазивное мониторирование распределения и З
локализации опухоль-специфических Т -клеток трансдуцированных CAR и ген -репортерной системой
3.3.1 In vitro оценка эффективности трансдукции человеческих Т -лимфоцитов ген-репортерной системой и CAR, и оценка их функциональной активности 88
3.3.2 ПЭТ/КТ визуализация локализации адоптивных опухоль-специфических Т-клеток трансдуцированных ген-репортерной системой и CAR 93
3.3.3 Гистология и иммунофлюоресцентный анализ образцов опухолевой ткани 96
3.4. Создание и оценка двойной ген-репортерной системы для визуализации двух независимых молекулярно биологических процессов в пределах одного организма (визуализация локализации и активация ген-модифицированных Т -клеток) 97
3.4.1 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов 98
3.4.2 Неинвазивная визуализация экспрессии ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ 103
3.4.3 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов 106
3.4.4 Неинвазивная визуализация экспрессии химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ. 110
3.4.5 Сравнительная, неинвазивная in vivo оценка экспрессии вновь созданных ген-репортерных с истем на основе мутированного варианта HSV1k, обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов и/или пиримидинов в пределах одного организма с помощью ПЭТ. 112 3.5 Создание и тестирование двойной ген-репортерной системы для визуализации локализации и оценки CD3 и/или CAR-зависимой активации Т -лимфоцитов. 116
3.5.1 In vitro оценка эффективности флюоресцентной визуализации и количественной оценки CD3 и CAR-зависимой активации Т -лимфоцитов, трансдуцированных NFAT-регулируемой ген-репортерной системой 116
3.5.2. ПЭТ визуализация локализации и CD3-зависимой активации Т -лимфоцитов на модели Jurkat инфильтратов используя двойную ген-репортерную систему 121
3.6. In vivo неинвазивная оценка возможности элиминации опухолевых клеток экспрессирующих ген-репортерные системы A167Ysr39tk и/или dCKDM 125
Обсуждение 132
Выводы 140
Практические рекомендации 143
Сокращения 145
Список литературы 147
