Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы 12
2.1. Эпизоотическая ситуация по АЧС 12
2.1.1. Пути распространения вируса АЧС 13
2.2. Патогенез и клинические проявления болезни 17
2.3. Характеристика вириона 19
2.3.1. Химические и физические свойства 19
2.3.2. Геном вируса АЧС 19
2.3.3. Полипептидный состав 27
2.3.4. Таксономическая принадлежность вируса АЧС 34
2.4. Лабораторная диагностика АЧС 35
2.4.1. Генотипирование вируса АЧС 38
2.5. Системы экспрессии для получения рекомбинантных белков 41
2.5.1. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках Е. coli 43
2.5.2. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей 45
2.5.3. Эукариотические векторы, используемые в клетках животных 46
2.5.4. Очистка и иммобилизация гибридных белков 48
2.6. Применение рекомбинантных белков в диагностике АЧС 49
2.7. Заключение по обзору литературы 54
3.Собственные исследования 55
3.1. Материалы и методы 55
3.1.1. Препараты вирусной ДНК 55
3.1.2. Ферменты 56
3.1.3. Растворы и реактивы 56
3.1.4. Штаммы Е. coli 59
3.1.5. Сыворотки 59
3.1.6. Антигены 60
3.1.7. Лабораторное оборудование 60
3.2. Методы 60
3.2.1. Очистка вируса АЧС 60
3.2.2. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 61
3.2.3. Полимеразная цепная реакция 61
3.2.4.Электрофорез ДНК 62
3.2.5. Рестрикция ДНК 62
3.2.6. Лигирование 62
3.2.7. Электропорация 62
3.2.8. Выделение плазмидной ДНК 63
3.2.9. Электрофорез белков 63
3.2.10. Иммуноферментный анализ 64
4. Результаты исследований 65
4.1. Клонирование генов рЗО и р72 вируса АЧС 65
4.1.1. Выбор участков и подбор праймеров для получения ПЦР-продуктов, содержащих последовательности генов р30ир72 65
4.1.2. Оптимизация ПЦР для получения продуктов, содержащих последовательности генов рЗО и р72 69
4.1.3. Применение праймеров p30F/R и p72F/R для выявления ДНК вируса АЧС 73
4.1.4. Чувствительность метода ПЦР 77
4.1.5.Выявление вирусной ДНК в пробах органов инфицирован ных животных 78
4.2. Клонирование и экспрессия генов рЗО и р72 80
4.2.1. Рестрикция ПЦР-продуктов и плазмидного вектора 80
4.2.2. Выделение тела плазмиды из геля агарозы 80
4.2.3.Трансформация лигазной смесью компетентных клеток Е. СОІІМ15 81
4.2.4. Скрининг рекомбинатных клонов 82
4.2.5. Экспрессия гибридных белков в клетках E.coli 87
4.2.6. Очистка гибридного белка, содержащего целлюлозо-связывающий домен 91
4.3. Использование рекомбинантного белка рЗО для выявления антител к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней на основе непрямого варианта ИФА 92
4.3.1. Проверка активности и специфичности рекомбинатного антигена 95
5. Обсуждение результатов исследований 98
6. Выводы 107
