Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Бактериальные токсины 8
1. 1.1. Стафилококковый энтеротоксин В 10
1. 1.2. Дифтерийный токсин 15
1.1.3. Столбнячный токсин 20
1. 1.4. Сибиреязвенный токсин 21
1.2. Растительные токсины 25
1.2. 1 .Рицин 25
1.2.2. Вискумин 31
1.3. Методы обнаружения биотоксинов в окружающей среде 32
1. 4. Белковые микрочипы 33
1.4.1. Двумерные белковые микрочипы для обнаружения биотоксинов 34
1.4. 2. Белковые микрочипы на основе гидрогелей 35
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 39
2.1. Белковые микрочипы 41
2. 2. Белковый гидрогелевый микрочип для обнаружения биотоксинов 44
2. 3. Регистрация результатов иммуноанализа 47
2.4. Исследование процессов, проходящих в объеме гелевой
ячейки 47
2.5. Различные варианты иммуноанализа анатоксина рицина, проводимые на микрочипе 50
2.6. Иммуноанализ анатоксинов: вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина 54
2.7. Прямой анализ анатоксина стафилококкового энтеротоксина В масс-спектрометрической регистрацией сигнала 56
2. 8. Параллельный анализ нескольких анатоксинов на микрочипах 57
2. 9. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами 60
2.10. Гликопротеиновый микрочип 61
2.10.1. Выбор способа иммобилизации углеводов в гелевом элементе микрочипа 61
2.10.2. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере анатоксина рицина) 66
2.11. Оптимизация условий для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа анатоксина рицина 69
2.12. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами 72
2.13. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 74
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
3.1. Приборы и реактивы 76
3.2. Получение анатоксинов и моноклональных антител против токсинов....77
3.3. Получение моноклональных антител против трисахаридов групп крови 78
3.4. Изготовление белковых микрочипов 78
3.5. Методика получения конъюгатов антител с биотином 79
3.6. Методика получения конъюгатов антител с пероксидазой хрена 79
3.7. Окрашивание белков флуоресцентными красителями СуЗ/Су5 80
3.8. Методики проведение анализов на микрочипах 80
3.8.1. Флуоресцентные и хемилюминесцентные измерения 80
3.8.2. Кинетические измерения на микрочипах 81
3.8.3. MALDI-TOF масс- спектральный анализ на микрочипе 82
3.8.4. Иммуноанализ анатоксинов на белковых микрочипах 83
3.8.5. Прямой иммуноанализ анатоксинов на микрочипах 83
3.8.6. Конкурентный иммуноанализ на микрочипах (анатоксин рицина) 84
3.8.7. Сэндвич- иммуноанализ анатоксинов 84
3.8.8. Одновременный анализ нескольких анатоксинов на
микрочипах 86
3.8.9. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами
3.9. Исследование при помощи флуоресцентного сканирующего конфокального микроскопа проникновения белков с различной молекулярной массой в гелевый элемент микрочипа (на примере прямого и сэндвич- анализа анатоксина рицина) 88
3.10. Определение степени иммобилизации белков (антител и анатоксинов) и сахаридов в геле 89
3.11. Гликочипы, содержащие иммобилизованные неогликоконъюгаты и спейсерированные трисахариди 89
3.12. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) культуральной жидкости, содержащей антитела против трисахарида А (А16) на 96-луночном планшете 90
3.13. Анализ сыворотки третьей группы крови на гликочипах, содержащих иммобилизованный трисахарид А в спейсерированной форме 91
3.14. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере анатоксина рицина) 91
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
