Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Рицин и виску мин - представители растительных РИБ II типа 8
1.1.1. Строение каталитических субъединиц рицина и виску мина 8
1.1.2. Строение связывающих субъединиц рицина и вискумина 10
1.1.3. Взаимодействие между субъединицами рицина и вискумина 14
1.2. Внутриклеточный транспорт белковых токсинов 17
1.2.1. Связывание с мембраной: рецепторы для рицина и вискумина 19
1.2.2. Интернализация токсинов внутрь клетки 20
1.2.3. Везикулярный транспорт белков в клетке 25
1.2.4. Прохождение токсинов через эндосомальные компартменты клетки 29
1.2.5. Транспорт токсинов в аппарат Гольджи 32
1.2.6. Ретроградный транспорт токсинов в эндоплазматическии ретикулум 36
1.2.7. Транслокация токсинов 40
Заключение 43
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Клетки 45
2.2. Животные 45
2.3. Выделение рицина и его субъединиц из растения Ricinus communis 45
2.4. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Viscum album 46
2.5. Получение гибридом, продуцирующих антитела против А-субъединицы рицина 48
2.6. Получение гибридом, продуцирующих антитела против В-субъединицы вискумина 49
2.7. Получение и очистка антител 49
2.8. Определение изотипа антител 50
2.9. Биотинилирование белков 50
2.10. Изучение взаимодействия антител с антигеном с помощью твердофазного иммуноферментного анализа 51
2.11. Конкурентный иммуноферментный анализ 53
2.12. Сэндвич-ТИФА на основе полученых монАт 53
2.13. Оценка галактозо-связывающей активности токсинов 54
2.14. Диссоциация субъединиц рицина и вискумина под действием дитиотреитола 54
2.15. Влияние монАт против MLB на взаимодействие вискумина и его В-цепи с асиалофетуином 55
2.16. Клеточный ИФА 55
2.17. Изучение рециклинга вискумина клетками ТА71 57
2.18. Влияние гуанидингидрохлорида на экспонирование эпитопа, узнаваемого антителами ТА71 58
2.19. Пептидный ТИФА 58
2.20. Оценка цитотоксической активности токсинов 59
2.21. Бесклеточная система трансляции 60
2.22. Электрофорез в системе Лэммли 61
2.23. Иммуноблоттинг 61
Глава 3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Изучение механизма действия рицина и вискумина на стадии внутриклеточной диссоциации 63
3.2. Ингибирующее действие вискумина на гибридомы, синтезирующие антитела против его связывающей субъединицы 74
3.3. Конформационные изменения А-субъединицы вискумина при внутриклеточной транслокации 89
Выводы 107
Список литературы
