Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Основные протективные антигены возбудителя холеры 16
1.1.1. Протективные антегены Vibrio cholerae Ol серогруппы 16
1.1.2. Протективные антигены V. cholerae 0139 серогруппы
1.2. Протективные антигены кишечной палочки 35
1.3. Живые холерные вакцины 39
Собственные исследования 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы 55
2.1. Бактериальные штаммы 55
2.2. Питательные среды и реактивы 56
2.3. Методы
2.3.1. Конъюгационные скрещивания 56
2.3.2. Метод популяционного анализа для изучения стабильности на следования плазмид в клетках изучаемых штаммов 57
2.3.3. Скрининг плазмид по методу C.J. Kado, S.T. Liu (1981) 57
2.3.4. Электрофорез белков холерного вибриона в полиакриламидном геле
2.3.5. Реакция маннозорезистентной гемагглютинации (МРГА) 58
2.3.6. Реакция пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммунофер ментный анализ (ELISA) з
2.3.7. Электронно-микроскопическое исследование 60
2.3.8. Определение продукции фосфолипазы и растворимой гемагглю-тинин/протеазы 61
2.3.9. Определение безвредности сконструированных штаммов на модельных лабораторных животных 62
2.3.10. Исследование колонизирующей способности созданных диплаз-мидных штаммов 63
2.3.11. Изучение антигенных свойств диплазмидных штаммов 64
2.3.12. Получение адсорбированной антисыворотки к адгезину СРАЯ и В-субъединице холерного токсина
2.3.13. Дот-иммуноанализ (ДИА) 64
2.3.14. Развернутая реакция агглютинации в пробирках для определения титра антител к адгезину СРАЯ в крови иммунизированных животных 66
2.3.15. Иммуноферментный метод (ELISA) 66
2.3.16. Оценка протективности сконструированного штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов 67
2.3.17. Метод RITARD, использованный для определения протективных свойств сконструированных штаммов 68
ГЛАВА 3. Конструирование рекомбинантных штаммов Е. COLI KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
3.1. Создание диплазмидного штамма Е. coli М17, содержащего реком бинантные плазмиды с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/1 70
3.2. Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клониро ванными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I J 76
ГЛАВА 4. Изучение стабильности наследования генов протек тивных антигенов и определение эффективности их экспрессии в созданных штаммах Е. Coli о] KM148(pIEM3)(pCFAI) и V, Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
4.1. Определение стабильности наследования рекомбинантных плаз мид в клетках штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cho
lerae КМ182(pIEM3)(pCFAI) в условиях in vitro и in vivo 81
4.2. Изучение экспрессии введенных генов протективных антигенов в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 83
4.2.1. Определение экспрессии генов В-субъединицы холерного токси на в клетках исследуемых штаммов 83
4.2.2. Определение экспрессии генов адгезина CFA/I в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 89
4.2.3; Изучение влияния чужеродного гена cfal на экспрессию собственных генов протективных антигенов у V. cholerae КМ182 94
ГЛАВА 5. Изучение безвредности, колонизирующей способно сти, антигенных и протективных свойств сконструированных диплазмидных штаммов Е. Coli КМ148 98 (pIEM3)(pCFAI) и V. Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
5.1. Изучение безвредности штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 98
5.2. Определение колонизирующей способности исследуемых диплаз мидных штаммов 100
5.2.1. Определение колонизирующей способности штамма кишечной палочки Е. coli КМ148 100
5.2.2. Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae КМ182 103
5.3. Определение антигенных свойств сконструированных диплазмид ных штаммов Е. со//КМ148и V. cholerae КМ182 105
5.3.1. Определение антигенных свойств штамма Е. coli КМ148 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных антико-лонизирующих и антитоксических антител 105
5.3.2. Определение антигенных свойств штамма V. cholerae КМ182 по на коплению в сыворотке крови иммунизированных животных анти колонизирующих и антитоксических антител 109
5.4. Определение протективных свойств исследуемых штаммов 112
5.4.1. Определение проте ктивности штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов 112
5.4.2. Определение протективных свойств штамма кишечной палочки Е. coli КМ148 методом RITARD 114
5.4.3. Определение протективных свойств сконструированного штамма V. cholerae КМ182 методом RITARD 117
Заключение 120
выводы 127
Список использованных источников литературы
