Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Строение и физико-химические свойства лактоферрина 8
1.1.1. Строение молекулы лактоферрина 8
1.1.2. Связывание ионов железа 11
1.1.3. Полимерные формы лактоферрина 12
1.1.4. Деление наизоформы 13
1.2. Метаболизм лактоферрина 13
1.3. Биологические функции лактоферрина 15
1.3.1. Транспорт ионов железа 15
1.3.2. Антимикробные свойства лактоферрина 16
1.3.2.1. Антибактериальная активность 16
1.3.2.2. Антивирусная активность 20
1.3.2.3. Антигрибковая активность 26
1.3.2.4. Антипаразитарная активность 28
1.3.3. Регуляция процессов воспаления 29
1.3.4. Участие ЛФ в процессах пролиферации и дифференцировки клеток 31
1.3.5. Иммуномодулирующие свойства лактоферрина 32
1.3.6. Взаимодействие лактоферрина с различными клетками организма 33
1.3.7. Связывание лактоферрина раковыми клетками. Противораковое действие 34
1.3.8. Взаимодействие лактоферрина с полианионами 35
1.3.8.1. Связывание гепарина 35
1.3.8.2. Взаимодействие с нуклеиновыми кислотами 36
1.3.9. Природа клеточных рецепторов к лактоферрину 37
1.3.10. Ферментативные активности лактоферрина 38
1.3.10.1. РНК-гидролизующая активность лактоферрина 38
1.3.10.2. Предполагаемый механизм гидролиза нуклеиновых кислот 39
1.3.10.3. Протеазная активность лактоферрина 39
1.3.11. Лактоферрин как ингибитор протеаз 40
1.3.12. Лактоферрин как фактор транскрипции 41
2. Материалы и методы 45
2.1. Реактивы и материалы 45
2.2. Методы 47
2.2.1. Получение сорбента анти-ЛФ-сефарозы 47
2.2.2. Выделение ЛФ из молока 47
2.2.3. Определение концентрации ЛФ 48
2.2.4. Получение железонасыщенного лактоферрина 48
2.2.5. Электрофоретический анализ белка 48
2.2.6. "Кислотный шок" препаратов ЛФ 49
2.2.7. Анализ олигомеризации ЛФ с помощью электрофореза 49
2.2.8. Протеолитическое расщепление ЛФ трипсином 49
2.2.9. Получение и очистка 5 -[32Р]-меченых олигонуклеотидов 49
2.2.10. Очистка нуклеотидов 50
2.2.11. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза олигонуклеотидов 50
2.2.12. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза ДНК фага X и ДНК плазмиды pBR-322 51
2.2.13. Определение нуклеотидфосфатазной активности ЛФ 51
2.2.14. Определение амилолитической активности ЛФ 51
2.2.15. Определение каталитических активностей ЛФ in situ 52
2.2.16. Определение кинетических параметров реакции гидролиза 53
2.2.17. Измерение спектров кругового дихроизма (КД) 53
2.2.18. Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния 53
2.2.19. Измерение светорассеяния 54
2.2.20. Спектрофлуориметрическое определение констант диссоциации комплексов ЛФ с нуклеотидами 55
2.2.21. Влияние нуклеотидов на связывание и гидролиз ON лактоферрином 55
2.2.22. Определение цитотоксичности ЛФ 56
3. Результаты и их обсуждение 57
3.1. Выделение изоформ лактоферрина 57
3.2. Анализ каталитических активностей ЛФ и его изоформ 63
3.2.1. Доказательства принадлежности каталитической активности изоформам ЛФ... 63
3.2.2. Тестирование активностей ЛФ in situ 64
3.2.3. Субстратная специфичность ЛФ 69
3.2.3.1. Нуклеазная и ДНК-фосфатазная активности изоформ ЛФ 69
3.2.3.2. Нуклеотидфосфатазная активность изоформ ЛФ 71
3.2.3.3. Амилолитическая активность изоформ ЛФ 74
3.2.4. ЛФ - как основная ДНКаза, РНКаза и АТРаза молока человека 75
3.2.5. Апоптоз клеток под действием ЛФ 76
3.3. Взаимодействие лактоферрина с АТР и другими нуклеотидами 80
3.3.1. Изучение взаимодействия ЛФ с нуклеотидами методом флуоресцентного титрования и кругового дихроизма 80
3.3.2. Взаимодействие ЛФ с различными нуклеотидами 84
3.3.3. Влияние нуклеотидов на комплексообразование ЛФ с ДНК и его ДНК-гидролизующую активность 86
3.3.4. Анализ возможной природы нуклеотид-связывающих центров ЛФ 91
3.4. Изучение влияния субстратов ЛФ на его олигомерное состояние 94
3.4.1. Олигомерные формы ЛФ в растворе 94
3.4.2. Изучение олигомерного состояния ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния и светорассеяния 95
3.4.3. Изучение олигомерных форм растворов лиофилизованного ЛФ 102
3.4.4. Влияние нуклеотидов на олигомеризацию ЛФ 104
3.4.5. Определение констант диссоциации комплексов олигомерных форм ЛФ с нуклеотидами методами СР и флуоресцентного титрования 107
3.4.6. Влияние олигонуклеотида и олигосахарида на олигомеризацию ЛФ 111
3.5. Природа полифункциональности ЛФ 120
4. Выводы 125
5. Список литературы 126
