Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Роль пептидов в живых организмах 8
1.1.1. Коммуникативные пептиды 9
1.1.2. Мембраноактивные пептиды 9
1.1.2.1. Строение мембраноактивных пептидов 9
1.1.2.2. Механизм действия мембраноактивных пептидов 10
1.1.2.3. Ингибиторы синтеза N0 13
1.2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства anura 14
1.2.1. Синтез пептидов в организме амфибий 15
1.2.2. Амфибии рода Rana и Hyla 16
1.2.3. Кожные пептиды ранидных лягушек 17
1.2.3.1. Мембраноактивные пептиды 17
1.2.3.1.1. Активность дисульфидсодержащих пептидов 19
1.2.3.1.2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи 2F
1.2.3.2. Нейропептиды ранидных лягушек 23
1.2.3.2.1. Тахикинины 23
1.2.3.2.2. Ранатензины ибомбезины 24
1.2.3.2.3. Брадикинины 25
1.2.4. Пептиды хилидных лягушек 27
1.2.4.1. Мембраноактивные пептиды 27
1.2.4.1.1. Семейство дермасептина 27
1.2.4.1.2. Пептиды-антибиотики австралийских квакш 29
1.2.4.2. Нейропептиды 31
1.2.4.2.1.Каерулиньї 31
1.2.4.2.2. Опиоидные пептиды 31
1.2.4.2.3. Триптофиллины 32
1.3. Секвенирование пептидов 33
1.3.1. Химические методы 33
1.3.1.1. Метод Эдмана 33
1.3.1.2. Леддерное секвенирование 34
1.3.2. Методы генной инженерии 35
1.3.3. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов и белков 36
1.3.3.1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации 37
1.3.3.1.1. Ионизация электрораспылением (ЭР) 38
1.3.3.1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) 39
1.3.3.2. Тандемная масс-спектрометрия 39
1.3.3.2.1. Диссоциация, активированная соударениями (ДАС) 41
1.3.3.2.2. Диссоциация при захвате (ДЭЗ) или переносе электрона (ДПЭ) 44
1.3.3.2.3. Фрагментация в МАЛДИ 48
1.3.3.3. Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей 50
1.3.3.4. Сложности масс-спектрометрического секвенирования 51
1.3.3.4.1. Изомерные и изобарные аминокислоты 51
1.3.3.4.2. Внутримолекулярная дисульфидная связь 54
1.3.3.4.3. Масс-спектрометрические методы разрушения S-S связей 58
1.3.3.4.4. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов 58
1.3.3.5. Модификация N-концевой аминогруппы 63
1.3.3.5.1. Введение незаряженной группы на N-конец пептида 63
1.3.3.5.2. Введение отрицательно заряженной группы на N-конец пептида 64
1.3.3.5.3. Введение положительно заряженной группы на N-конец пептида 66
2. Обсуждение результатов 69
2.1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов 70
2.2. Оптимизация вэжх разделения кожных секретов 70
2.3. Детальное масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек 71
2.3.1. Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ 71
2.3.2. Ранидные лягушки 73
2.3.2.1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов 74
2.3.2.2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидометилировании и окислении дисульфидных связей 80
2.3.2.3. Кожный пептидом озерной лягушки, Rana ridibimda 83
2.3.2.4. Кожный пептидом прудовой лягушки, Rana lessonae 87
2.3.2.5. Кожный пептидом съедобной лягушки, Rana esculenta 92
2.3.2.6. Кожный пептидом травяной лягушки, Rana temporaria 97
2.3.2.7. Кожный пептидом остромордой лягушки, Rana arvalis 102
2.3.3. Хилидные лягушки 107
2.3.3.1. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов 107
2.3.3.2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов 110
2.3.3.3. Кожный пептидом квакши обыкновенной, Hyla arborea 114
2.4. Экспресс-профилирование кожных секретов ранидных лягушек 118
3. Экспериментальная часть 126
Выводы 130
Список литературы 131
