Введение
2. Обзор литературы 10.
2.1. Бактериолитические ферменты 11.
2.1.1. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 12.
2.1.2. Свойства бактериолитических ферментов 13.
2.1.3. Применение бактериолитических ферментов в научной и практической деятельности человека 13.
2.1.4. Внеклеточные бактериолитические комплексы 14.
2.2. Структура клеточной стенки бактерий 21.
2.3. Пептидогликан клеточной стенки 24.
2.3.1. Структура и классификация пептидогликана 24.
2.3.2. Влияние структуры пептидогликана на активность литических ферментов 29.
2.4. Анионные полимеры клеточной стенки бактерий 30.
2.4.1. Тейхоевые кислоты 32.
2.4.2. Тейхуроновые кислоты 34.
2.4.3. Липотейхоевые кислоты 34.
2.4.4. Анионные полимеры как рецепторы автолитических ферментов 34.
2.5. Механизм действия литических ферментов на клеточные Стенка грамположительных бактерий-мишеней 36.
2.5.1. Механизм действия эндопептидазы лизостафина Staphylococcus simulans на клеточную стенку Staphylococcus aureus 38.
2.5.2. Механизм действия автолизина Staphylococcus aureus на клеточную стенку S. aureus 40.
2.5.3. Механизм действия фаг-кодируемых гидролаз пептидогликана на клеточную стенку S. aureus 42.
2.5.4. Механизм действия автолизина Streptococcus pneumoniae на клеточную стенку пневмококка с холином 42.
2.6. Действие литических ферментов на грамотрицательные бактерии-мишени 44.
3.Материалы и методы 47.
3.1. Материалы 48.
3.2. Микроорганизмы и условия культивирования 48.
3.3. Определение ферментативных активностей 49.
3.3.1. Определение бактериолитической активности 49.
3.3.2. Определение протеолитической активности 49.
3.3.3. Определение фосфатазной активности 49.
3.4. Очистка ферментов лизоамидазы 49.
3.4.1. Выделение мурамидазы 49.
3.4.2. Выделение пептидазы Л1 50.
3.4.3. Выделение пептидазы Л2 50.
3.5. Определение молекулярных масс ферментов 50.
3.6. Определение температурной инактивации ферментов 51.
3.7. Определение температурного оптимума литических ферментов 51.
3.8. Определение рН-оптимума литических ферментов 51.
3.9. Определение оптимального значения ионной силы буфера 51.
3.10. Получение клеточных стенок бактерий 51.
3.10.1. Получение клеточной стенки Staphylococcus aureus 209-Р 51.
3.10.2. Получение клеточных стенок Streptomyces chrysomallus ВКМ АС628, Streptomyces roseoflavus var. roseofungini ВКМ Ac770, Streptomyces azureus РИА 1009, Glycomyces harbinensis BKM Ac-1247 и Nocardiopsis dassonvillei IMRU-509 52.
3.11. Получение пептидогликана 52.
3.12. Получение тейхоевых кислот 52.
3.13. Идентификация тейхоевых кислот 52.
3.14. Гидролиз клеточной стенки Staphylococcus aureus 209 Р 53.
3.15. Изучение действия лизоамидазы на клетки, клеточные стеЪки, и пептидогликан грамположительных бактерий 53.
3.16. Изучение действия бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, и пептидогликан грамположительных бактерий 53.
3.17. Изучение влияния гомологичной тейхоевой кислоты, добавленной в реакционную смесь, на активность лизоамидазы 53.
3.18. Влияние экранирования заряда тейхоевых, тейхуроновых кислот двухвалентными катионами на бактериолитическую активность лизоамидазы и её ферментов 54.
3.19. Периодатное окисление тейхуроновых кислот клеточной стенки бактерий .54.
3.20. Изучение действия лизоамидазы на клетки и пептидогликан грамотрицательных бактерий 54.
3.20.1. Изучение влияния полимиксина В на действие лизоамидазы на грамотрицательные бактерии-мишени 54.
3.20.2. Изучение влияния отрицательно заряженного липополи- сахарида Esherichia coli на действие лизоамидазы на пептидогликан Е. coli 54.
3.21. Получение полисахарида лизоамидазы 54.
3.22. Изучение взаимодействия полисахарида лизоамидазы и её литических ферментов 55.
3.23. Аналитические методы 55.
3.23.1. Определение концентрации белка 55.
3.23.2. Определение содержания полисахаридов 55.
3.23.3. Кислотный гидролиз клеточной стенки, пептидогликана и тейхоевых кислот 55.
3.23.4. Определение фосфора 56.
3.23.5. Определение количества тейхоевой кислоты в клеточной стенке бактерий 56.
3.23.6. Определение количества пептидогликана в клеточной стенке бактерий 56.
3.23.7. Определение редуцирующих Сахаров 57.
3.23.8. Определение свободных №І2-групп 57.
3.23.9. Определение способности ферментов гидролизовать синтетический субстрат для муромидазы 57.
3.23.10. Определение способности ферментов гидролизовать синтетический субстрат для протеазы 57.
4. Результаты и обсуждение 58.
4.1. Очистка бактериолитических ферментов лизоамидазы 59.
4.1.1. Выделение бактериолитической пептидазы III 59.
4.1.2. Выделение мурамидазы. 66.
4.2. Характеристика бактериолитических ферментов лизоамидазы 66.
4.2.1. Физико-химические свойства пептидазы Л1 66.
4.2.2. Физико-химические свойства мурамидазы 71.
4.2.3. Физико-химические свойства пептидазы Л 2 71.
4.3. Определение субстратной специфичности Л1 и Л2- бактериолитических пептидаз 82.
4.4. Изучение роли теихоевых, теихуроновых кислот в механизме действия лизоамидазы и её ферментов на клетки грамположи тельных бактерий. 85.
4.4.1. Действие бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточную стенку, содержащую рибиттейхоевую кислоту, и пептидогликан Staphylococcus aureus 209 Р 86.
4.4.2. Действие бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, содержащие разное количество рибиттейхоевых кислот, и пептидогликан Streptomyces chrysomallus ВКМ Ас-62. 88.
4.4.3. Действие лизоамидазы на клеточные стенки, содержащие 20% тейхоевой кислоты рибитфосфатной природы, и пептидогликан Streptomyces azureus РИА 1009 90.
4.4.4. Действие лизоамидазы на клеточные стенки Streptomyces roseoflavus var.roseofungini ВКМ Ас-770, Nocardiopsis dassonvillei IMRU 509, Glycomyces harbinensis BKM Ac - 1247 содержащие глицеринтейхоевые кислоты 92.
4.4.5. Действие лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, в состав которых входят тейхуроновые кислоты, пептидогликан Bacillus subtilis W-23 .93.
4.5. Действие лизоамидазы на грамотрицательные бактерии-мишени 95.
4.6. Изучение влияния полисахарида лизоамидазы на активность бактериолитических ферментов 97.
Заключение 99.
Выводы 102.
Литература 104.
